大鼠神經(jīng)生長因子(NGF) Elisa試劑盒說明書
上海慧穎生物科技有限公司
大鼠神經(jīng)生長因子(NGF) Elisa試劑盒說明書僅供研究使用
檢測范圍:0.156 ng/ml - 10 ng/ml
zui低檢測限:0.04 ng/ml
特異性:本試劑盒可同時檢測天然或重組的大鼠NGF,,且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
有效期:6個月
預期應(yīng)用:ELISA法定量測定大鼠血清、血漿,、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中NGF含量,。
說明
1.試劑盒保存:-20℃(較長時間不用時),;2-8℃(頻繁使用時)。
2.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,,稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
3.中、英文說明書可能會有不*之處,,請以英文說明書為準,。
4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
概述
神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin, NT)是一類由神經(jīng)所支配的組織(如肌肉)和星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的且為神經(jīng)元生長與存活所必需的蛋白質(zhì)分子,。神經(jīng)營養(yǎng)因子通常在神經(jīng)末梢以受體介導式入胞的方式進入神經(jīng)末梢,,再經(jīng)逆向軸漿運輸?shù)诌_胞體,促進胞體合成有關(guān)的蛋白質(zhì),,從而發(fā)揮其支持神經(jīng)元生長,、發(fā)育和功能完整性的作用。近年來,,也發(fā)現(xiàn)有些 NT 由神經(jīng)元產(chǎn)生,,經(jīng)順向軸漿運輸?shù)竭_神經(jīng)末梢,對突觸后神經(jīng)元的形態(tài)和功能完整性起支持作用,。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,,NGF)是人類發(fā)現(xiàn)的*個神經(jīng)營養(yǎng)因子,是多功能多肽生長因子,。NGF 廣泛存在于人和多種動物體內(nèi),。
大鼠神經(jīng)生長因子(NGF) Elisa試劑盒說明書實驗原理
用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,,往包被抗NGF抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗NGF抗體、HRP標記的親和素,,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的NGF呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度,。
大鼠神經(jīng)生長因子(NGF) Elisa試劑盒說明書組成及試劑配制
- 酶聯(lián)板(Assay plate ):一塊(96孔),。
- 標準品(Standard):2瓶(凍干品)。
- 樣品稀釋液(Sample Diluent):1×20ml/瓶,。
- 生物素標記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent):1×10ml/瓶,。
- 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 (HRP-avidin Diluent):1×10ml/瓶,。
- 生物素標記抗體(Biotin-antibody):1×120μl/瓶(1:100)
- 辣根過氧化物酶標記親和素(HRP-avidin):1×120μl/瓶(1:100)
- 底物溶液(TMB Substrate):1×10ml/瓶。
- 濃洗滌液(Wash Buffer):1×20ml/瓶,,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
- 終止液(Stop Solution):1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
需要而未提供的試劑和器材
- 標準規(guī)格酶標儀
- 高速離心機
- 電熱恒溫培養(yǎng)箱
- 干凈的試管和Eppendof管
- 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,,一次檢測樣品較多時,,用多通道移液器
6. 蒸餾水,容量瓶等
標本的采集及保存
- 血清:全血標本請于室溫放置2小時或4℃一夜后于1000 x g離心20分鐘,,取上清即可檢測,,或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復凍融,。
- 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,,或將標本放于-20℃或-80℃保存,,但應(yīng)避免反復凍融。
- 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本:1000 x g離心20分鐘,,取上清即可檢測,,或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復凍融,。
注:標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,,因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則:
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量,,確定適當?shù)南♂尡稊?shù),。只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi),檢測的結(jié)果才是準確的,。稀釋的過程中,,應(yīng)做好詳細的記錄。zui后計算濃度時,,稀釋了“N”倍,,標本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
標準品的稀釋原則:2瓶,,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,,其濃度為10 ng/ml,,做系列倍比稀釋后,分別稀釋10 ng/ml,,5 ng/ml,,2.5 ng/ml,,1.25 ng/ml,0.625 ng/ml,,0.312 ng/ml,,0.156 ng/ml,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml,,臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制5 ng/ml標準品:取0.5ml(不要少于0.5ml)10 ng/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,,其余濃度以此類推,。
生物素標記抗體的稀釋原則:
臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100μl),,實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,,在使用前一小時內(nèi)配制,。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則:
臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100μl),,實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制,輕輕混勻,,在使用前一小時內(nèi)配制,。
大鼠神經(jīng)生長因子(NGF) Elisa試劑盒說明書操作步驟
實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?,試劑或樣品稀釋時,,均需混勻,混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線,。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進行稀釋,,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。
- 加樣:分別設(shè)空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μl,,余孔分別加標準品或待測樣品100μl,,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,,輕輕晃動混勻,,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘,。
為保證實驗結(jié)果有效性,,每次實驗請使用新的標準品溶液。
- 棄去液體,,甩干,,不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl(取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,,輕輕混勻,,在使用前一小時內(nèi)配制),37℃,60分鐘,。
- 溫育60分鐘后,,棄去孔內(nèi)液體,甩干,,洗板3次,,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,,甩干,。
- 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液(同生物素標記抗體工作液) 100μl,,37℃,,60分鐘。
- 溫育60分鐘后,,棄去孔內(nèi)液體,,甩干,洗板5次,,每次浸泡1-2分鐘,,350μl/每孔,甩干,。
- 依序每孔加底物溶液90μl,,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,,后3-4孔梯度不明顯,,即可終止)。
- 依序每孔加終止溶液50μl,,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色),。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
- 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值),。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
注:
1. 用戶在初次使用試劑盒時,,應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,,以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,,該孔不加任何試劑,,只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。
3. 為防止樣品蒸發(fā),,試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標板加上蓋或覆膜,。
4. 未使用完的酶標板或者試劑,,請于2-8℃保存。標準品,、生物素標記抗體工作液,、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品,、生物素標記抗體工作液,、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,,以保證檢測結(jié)果的準確性,。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,,酶標板朝下用力拍幾次,;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,,重復此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機,,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
計算
以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),,在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù),;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),,即為樣品的實際濃度,。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩,避免起泡,。
2. 洗滌過程非常重要,,不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),,如標本數(shù)量多,,推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線,,做復孔,。
5. 如標本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時,,請以相應(yīng)的稀釋液配制,,不能混淆。
7. 底物請避光保存,。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。