慧穎 HCT-8/VCR細胞 耐藥株 中文名稱：耐長春新堿結腸癌細胞系,，人?；鄯f提供HCT-8/VCR細胞價格,，耐藥倍數，形態(tài),，來源,，STR鑒定，細胞特征特性,，培養(yǎng)條件,，操作注意事項,，訂購流程，售后說明等,?；鄯f生物注重產品品質，提供zui的產品和售后,，自公司成立以來,，獲得了同行業(yè)的*。六月,，是繁忙的,，六月是收獲的季節(jié)，沉甸甸的麥穗,，已經顆粒歸倉,。六月我們一起前行，成就人生,，慧穎祝您萬事如意,，心想事成。

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封閉

在轉膜之后,，也就是抗體孵育之前，需要對膜進行封閉,。封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質結合而不是和膜結合,。常用的封閉液有BSA，脫脂奶粉,，血清等,，一般用的是脫脂奶粉。脫脂奶粉有些特殊情況是不適用的 ,，脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用,；不能用于磷酸化抗體對蛋白磷酸化的檢測；不能用于堿性磷酸酶（AP）顯示方法,。

抗體孵育——WB真正的難點：抗體的使用是一種藝術,，一種抗體一個脾氣。

對WB結果有決定性影響的因素是抗體的效價和如果正確使用手中的抗體,。 無論你如何提高自己的轉膜技術,，和低效之間往往只有數倍的差異， 而抗體的效價可以差數千倍以上,；同樣,，正確使用抗體可以保證抗體效價 不被過分的拮抗，謀求特異性和非特異性背景之間差異的zui大化,。

一抗：*抗體能和非抗體性抗原特異性結合的蛋白,，包括單克隆抗體和多克隆抗體；二抗：第二抗體能和一抗結合,，即抗體的抗體,，其主要作用是檢測抗體的存在，放大一抗的信號,。一般二抗都會偶聯(lián)可以檢測的標記（如熒光,、放射性、化學發(fā)光或顯色基團）,，用來檢測一抗,；如果一抗本身偶聯(lián)有這些標記，則不需要二抗，就是所謂的直接WB,。

那么如何正確的來選擇二抗呢,？*根據一抗的種屬來源選擇二抗；第二根據一抗的類型選擇二抗,，根據單體數量和重鏈分類,，將抗體分為IgA，IgD,，IgE,，IgG，IgM五類,。其中又可分為幾個亞型：IgA1-2,，IgG1a，2a,，2b,，3，IgM1-2,。

顯色

酶促反應可以搭配不同的底物從而實現(xiàn)不同的顯色方法：化學發(fā)光Chemiluminescent 和底物顯色Colormetirc/Chromogen,，前者靈敏度很高——隨著各大廠家努力開發(fā)研制靈敏度更高的發(fā)光底物，化學發(fā)光法的靈敏度已經達到pg別,，甚至還有 Femto級別的,，靈敏度超過了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低,。zui為大家熟悉當數辣根過氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase,，屬于過氧化物酶POD類）和堿性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）,、β半乳糖苷酶 β-Galactosidase ,。

常見問題分析：

1.曝光后背景過高且不均勻

封閉不充分：延長封閉時間，更換合適的封閉劑,；一抗?jié)舛冗^高：增加一抗稀釋倍數,；抗體孵育溫度過高：4℃孵育；二抗非特異性結合或與封閉劑交叉反應：設置二抗對照（不加一抗）,，降低二抗?jié)舛取?/span>

洗膜不充分：增加洗膜次數

2.沒有陽性條帶或很弱

一抗,、二抗不匹配：訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物,，可通過設置內參驗證二級系統(tǒng)的有效性,； 更換更好的抗體；一抗,，二抗?jié)舛鹊停涸黾涌贵w濃度,，延長孵育時間封閉劑與一抗有交叉反應：封閉時使用溫和的去污劑,，更換封閉劑樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過少，設置陽性對照,，如果陽性對照有結果,，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或是靶蛋白含量太低，后者可增加樣本上樣量,；轉膜不充分還洗膜過度：使用麗春紅S檢測轉膜效果，PVDF膜需浸透,，正確的轉膜操作,，勿過度洗膜；曝光時間過短：延長曝光時間,，更換更靈敏的發(fā)光液

3.背景有白色/黑色斑

轉膜時有氣泡或抗體分布不均：盡量除去氣泡,，抗體孵育時保持搖動；封閉劑溶解不充分有顆粒狀

HCT-8/VCR細胞凍存：

１．將細胞消化下來,，移入離心管離心,，棄上清

２．準備凍存液比例：５０％ＦＢＳ＋４０％培養(yǎng)基＋１０％ＤＭＳＯ（現(xiàn)用現(xiàn)配）

３．加１．５凍存液在離心管中，將細胞吹打均勻,，移入凍存管內．

放入－２０度冰箱２－４小時后．再放入－８０度冰箱過ye,，第二天放入液氮罐保存.

HCT-8/VCR細胞常見的污染如下：

1、細菌：細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀,，根據感染細菌的不同,，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃,，對細胞生長影響明顯,。

2、霉菌：培養(yǎng)液是清亮的,，倒置顯微鏡下無雜質,，37度孵箱培養(yǎng)2-3天，仍清亮,，但出現(xiàn)絮狀雜質,，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，可看到明顯的菌絲,，細胞仍可生長,，但時間長之后，細胞的活力狀態(tài)變差,，

用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內,，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅?；蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染,。

3,、支原體：黑色的，好象多為多形,，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會渾濁,，原體感染，國內血清很多都沒有做支原體陰性檢測,，而支原體是牛血清中zui常見的微生物之一,。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細胞以后,，細胞病變不很明顯,，只是慢慢凋亡。

4,、黑蛟蟲：可以穿透濾膜,，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀,，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去,，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響,，細胞還是可以用的,。

5、真菌：一般培養(yǎng)液清亮,，不變色,，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細胞碎片,，只是它很多很多的小塊很清楚,，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清,，慢慢的會長出很細的黑色絲狀物,。真菌生長的比較慢，不象細菌那么容易被發(fā)現(xiàn),，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細胞就被污染了,，也很難救活了。

6,、原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁,，顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多，輕微活動,，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,，而且細胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚,，細胞不透亮,。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養(yǎng),。這種共生是非常普遍的，但他們的數量小,，細胞站優(yōu)勢所以不會影響到細胞的正常生長,，只有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長，zui終形成惡性循環(huán),。

HCT-8/VCR細胞運輸：凍存的細胞干冰運輸,，復蘇的細胞冰袋運輸。冬季我們會選擇全血清包被細胞株運輸,，運輸途中細胞處于休眠狀態(tài),，避免天氣過冷導致的細胞死亡。