ECV-304細(xì)胞 ECV-304細(xì)胞；中文名稱：臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系,，人,。慧穎提供ECV-304細(xì)胞價(jià)格,，形態(tài),，來源，STR鑒定,，細(xì)胞特征特性,，培養(yǎng)條件，操作注意事項(xiàng)，訂購(gòu)流程,，售后說明等,?；鄯f生物注重產(chǎn)品品質(zhì),，提供zui的產(chǎn)品和售后,，自公司成立以來,，獲得了同行業(yè)的*,。六月,，是繁忙的，六月是收獲的季節(jié),，沉甸甸的麥穗,，已經(jīng)顆粒歸倉(cāng)。六月我們一起前行,，成就人生,，慧穎祝您萬事如意，心想事成,。

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封閉

在轉(zhuǎn)膜之后,，也就是抗體孵育之前，需要對(duì)膜進(jìn)行封閉。封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。常用的封閉液有BSA,，脫脂奶粉,，血清等，一般用的是脫脂奶粉,。脫脂奶粉有些特殊情況是不適用的 ,，脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用；不能用于磷酸化抗體對(duì)蛋白磷酸化的檢測(cè),；不能用于堿性磷酸酶（AP）顯示方法,。

抗體孵育——WB真正的難點(diǎn)：抗體的使用是一種藝術(shù),，一種抗體一個(gè)脾氣。

對(duì)WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價(jià)和如果正確使用手中的抗體,。 無論你如何提高自己的轉(zhuǎn)膜技術(shù),，和低效之間往往只有數(shù)倍的差異， 而抗體的效價(jià)可以差數(shù)千倍以上,；同樣,，正確使用抗體可以保證抗體效價(jià) 不被過分的拮抗，謀求特異性和非特異性背景之間差異的zui大化,。

一抗：*抗體能和非抗體性抗原特異性結(jié)合的蛋白,，包括單克隆抗體和多克隆抗體；二抗：第二抗體能和一抗結(jié)合,，即抗體的抗體,，其主要作用是檢測(cè)抗體的存在，放大一抗的信號(hào),。一般二抗都會(huì)偶聯(lián)可以檢測(cè)的標(biāo)記（如熒光,、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)）,，用來檢測(cè)一抗,；如果一抗本身偶聯(lián)有這些標(biāo)記，則不需要二抗,，就是所謂的直接WB,。

那么如何正確的來選擇二抗呢？*根據(jù)一抗的種屬來源選擇二抗,；第二根據(jù)一抗的類型選擇二抗,，根據(jù)單體數(shù)量和重鏈分類，將抗體分為IgA,，IgD,，IgE，IgG,，IgM五類,。其中又可分為幾個(gè)亞型：IgA1-2,，IgG1a，2a,，2b,，3，IgM1-2,。

顯色

酶促反應(yīng)可以搭配不同的底物從而實(shí)現(xiàn)不同的顯色方法：化學(xué)發(fā)光Chemiluminescent 和底物顯色Colormetirc/Chromogen,，前者靈敏度很高——隨著各大廠家努力開發(fā)研制靈敏度更高的發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光法的靈敏度已經(jīng)達(dá)到pg別,，甚至還有 Femto級(jí)別的,，靈敏度超過了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡(jiǎn)便且成本低,。zui為大家熟悉當(dāng)數(shù)辣根過氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase,，屬于過氧化物酶POD類）和堿性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase）,，此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）,、β半乳糖苷酶 β-Galactosidase 。

常見問題分析：

1.曝光后背景過高且不均勻

封閉不充分：延長(zhǎng)封閉時(shí)間,，更換合適的封閉劑,；一抗?jié)舛冗^高：增加一抗稀釋倍數(shù)；抗體孵育溫度過高：4℃孵育,；二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)：設(shè)置二抗對(duì)照（不加一抗）,，降低二抗?jié)舛取?/span>

洗膜不充分：增加洗膜次數(shù)

2.沒有陽性條帶或很弱

一抗、二抗不匹配：訂購(gòu)試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬,，一抗與二抗或底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物,，可通過設(shè)置內(nèi)參驗(yàn)證二級(jí)系統(tǒng)的有效性； 更換更好的抗體,；一抗,，二抗?jié)舛鹊停涸黾涌贵w濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間封閉劑與一抗有交叉反應(yīng)：封閉時(shí)使用溫和的去污劑,，更換封閉劑樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過少,，設(shè)置陽性對(duì)照，如果陽性對(duì)照有結(jié)果,，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或是靶蛋白含量太低,，后者可增加樣本上樣量；轉(zhuǎn)膜不充分還洗膜過度：使用麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果,，PVDF膜需浸透,，正確的轉(zhuǎn)膜操作，勿過度洗膜,；曝光時(shí)間過短：延長(zhǎng)曝光時(shí)間,，更換更靈敏的發(fā)光液

3.背景有白色/黑色斑

轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡或抗體分布不均：盡量除去氣泡,，抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)；封閉劑溶解不充分有顆粒狀

ECV-304細(xì)胞 ECV-304細(xì)胞運(yùn)輸：凍存的細(xì)胞干冰運(yùn)輸,，復(fù)蘇的細(xì)胞冰袋運(yùn)輸,。冬季我們會(huì)選擇全血清包被細(xì)胞運(yùn)輸，運(yùn)輸途中細(xì)胞處于休眠狀態(tài),，避免天氣過冷導(dǎo)致的細(xì)胞死亡,。

ECV-304細(xì)胞 ECV-304細(xì)胞在運(yùn)輸、轉(zhuǎn)移過程中,，請(qǐng)勿打開自封袋；拿放細(xì)胞時(shí)請(qǐng)持瓶體,，切勿在非無菌環(huán)境中碰觸、擰動(dòng)瓶口封口膜位置

進(jìn)入生物安全柜前,，打開自封袋拿出培養(yǎng)瓶,，噴上酒精放進(jìn)操作臺(tái)(不建議使用酒精棉球擦拭),，撕開封口膜后,，用酒精燈外焰對(duì)瓶口燒灼一圈(3秒左右)

細(xì)胞凍存如下：

1．細(xì)胞：選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,，收集細(xì)胞24小時(shí)前換液一次,。

2．計(jì)數(shù)：按常規(guī)方法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù),，令細(xì)胞密度達(dá)5×106/ml,，離心去上清，吸入離心管中,。

3．凍存液：先用培養(yǎng)液9分＋DMSO 1分(或甘油)配成10％的DMSO凍存液，按上法一滴滴加入離心管中,，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸,。

4．分裝：分裝入無菌安剖中,，每安剖加1.5毫升細(xì)胞懸液,。

5．封口：用塑料安剖時(shí)擰緊瓶口即可,；如用火焰封閉安剖口后,，仔細(xì)檢查，定要封嚴(yán),，必要時(shí)可浸入藍(lán)色液中觀察,，為安全起見，把安剖縫入紗布小袋中,，以防液氮浸入后,，融解時(shí)因受熱發(fā)生爆炸傷人,；紗袋一端系以線繩,，末端扎有小牌,，注明：細(xì)胞名稱,，凍存日期，以便日后查找,。

豎立培養(yǎng)瓶，擰開瓶蓋(如是貼壁細(xì)胞,，請(qǐng)用真空泵或吸管移除原配培養(yǎng)基,，切勿讓瓶口處的液體回流進(jìn)瓶?jī)?nèi))

更換為含10%-20%血清的*培養(yǎng)基，嚴(yán)格按照無菌操作要求繼續(xù)培養(yǎng),。