1.試劑和溶液

1）轉(zhuǎn)印緩沖液：0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇

2）氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B

3）1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl ,0.1%Tween 20

4）封閉液：TBST配制的5%牛奶

5）抗體稀釋液：TBST配制的5%牛奶

6）顯色系統(tǒng)：ECL顯色

2.實驗步驟

1電泳：將裂解液進行SDS-PAGE電泳,，80v，30分鐘,，120v,，90分鐘；

2轉(zhuǎn)膜：PVDF膜在甲醇中浸泡約30秒左右,，濾紙浸泡在轉(zhuǎn)印緩沖液預(yù)濕,，半干法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，10v,，150分鐘,；

3染色：氨基黑染色5分鐘，甲醇褪去背景色,，觀察條帶,；

4膜活化：將PVDF膜置于甲醇活化1min，用純水洗膜2次后再用TBST洗滌3次,；

5封閉：將膜條置于5%牛奶或2% BSA中,，室溫混搖2h；

6一抗孵育：將待檢抗體用3%牛奶或2% BSA稀釋到合適濃度（參照抗體說明書,，根據(jù)客戶預(yù)實驗結(jié)果,，稀釋度上下浮動一個數(shù)量級都為正常）,，將膜放入對應(yīng)的已稀釋待檢樣品中，置4℃混搖孵育隔夜,；

7洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min,；

8二抗孵育：將膜取出放入稀釋好的HRP標(biāo)記的二抗（參照二抗說明書進行稀釋）中，室溫混搖2h,；

9洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min,；

10ECL顯色：將膜取出放入混勻的ECL顯色液中，孵育3min,，將膜取出貼在有熒光角標(biāo)的膠片上,，迅速用保鮮膜包好；

11曝光：把底片放在暗盒中,，根據(jù)熒光強度分別對X光膠片作不同時間段的曝光,，曝光結(jié)束后，將底片取出,，1min顯影，30s清洗,，1min定影,，30s清洗，晾干,；

12結(jié)果分析：用掃描儀將曝光后的X光膠片掃描,，做后續(xù)結(jié)果分析。

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