超低IgG胎牛血清Ultra-low IgG FBS·透析胎牛血清Dialyzed FBS·活性炭/葡聚糖處理胎牛血清Charcoal Stripped FBS

一,、牛血清質(zhì)量檢定指標

1、化學檢定：包括滲透壓（240～340）,、pH（7.0～8.0）,、總蛋白含量（3.5～5.0％）、血紅蛋白 （≤0.02％）

2,、 微生物檢查：細菌和真菌——直接培養(yǎng)法,、噬菌體——噬斑法和增殖法 支原體——培養(yǎng)法和DNA染色法 、牛病毒——細胞培養(yǎng)法,。要求均為陰性

3,、內(nèi)毒素檢測——凝膠法和動態(tài)濁度法 要求內(nèi)毒素含量≤10EU/ml

4、促細胞生長測定（SP2/0-Ag14標準規(guī)定）

1）zui大增殖濃度≥1.0×106個/ml,、倍增時間≤20小時

克隆率＝（陽性孔平均數(shù)/培養(yǎng)孔總數(shù)）×100％

2）貼壁效率（ VERO細胞,、二倍體細胞等）

10％血清――50或100個細胞/孔

貼壁效率（％）＝（每孔克隆平均數(shù)/每孔存活的培養(yǎng)細胞平均數(shù)）×100

相對貼壁效率＝被測血清貼壁效率/參考血清貼壁效

以上項目檢定結(jié)果應(yīng)符合2005版《中國藥典》第三部的相關(guān)規(guī)定。血清廠家應(yīng)在此基礎(chǔ)上結(jié)合疫苗病毒生產(chǎn)工藝建立企業(yè)內(nèi)控檢定項目并建立相應(yīng)的檢定方法,，保證疫苗病毒生產(chǎn)的穩(wěn)定性，提高疫苗制品的質(zhì)量,。

二,、牛血清的分類

根據(jù)牛出生時間和血清采制分離方法分為：

1、胎牛血清：八月齡胎牛心臟穿刺取血,；

2,、新生牛血清：出生12～24小時新生牛靜脈采血；

新生牛血清：采血后靜置自然析出的血清,；

標準新生牛血清：經(jīng)離心分離的血清,；

普通新生牛血清：融血或微融血的血清；

3,、小牛血清：出生三月齡小牛動脈采血分離血清,；

三、牛血清在細胞培養(yǎng)基中的主要功能

牛血清是細胞培養(yǎng)中用量zui大的天然培養(yǎng)基,，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份,，具有極為重要的功能。

1,、提供能促使細胞指數(shù)生長的激素,、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或含量微小的營養(yǎng)物，以及某些低分子營養(yǎng)物質(zhì),；

2,、提供結(jié)合蛋白,，識別維生素、脂類,、金屬離子,，并與有毒金屬和熱源物質(zhì)結(jié)合，起解毒作用,；

3,、是細胞貼壁、鋪展生長所需因子的來源,；

4,、起酸堿度緩沖液作用；

5,、提供蛋白酶抑制劑,，細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受損傷,。

四,、牛血清的質(zhì)量要求

一）WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家，并應(yīng)具備適當?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng),。

2.有些國家還要求牛血清來自沒有用過反芻動物蛋白飼料喂養(yǎng)的牛群,。

3.要能證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通過濾膜過濾除菌,，保證無菌,。

5.無細菌、霉菌,、支原體和病毒的污染,，有些國家要求無大腸桿菌噬菌體污染。

6.要求血清對細胞有良好的支持繁殖作用,。

（二）我國在對牛血清的質(zhì)量標準zui早在2000年版《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準》中提出,。包括物理性狀、總蛋白,，血紅蛋白,、細菌、真菌,、支原體,、牛病毒、大腸桿菌噬菌體,、細菌內(nèi)毒素,，支持細胞增殖檢查。2005版藥典頒布之后,，小牛血清質(zhì)量標準被納入《中國藥典》2005年版 第三部 生物制品分冊,。

（三）美國對牛血清的質(zhì)量要求：

Gibco 和Hyclone等美國主要血清供應(yīng)商的牛血清都已進入到我國市場,，他們對血清質(zhì)量標準有嚴格要求，從血清來源到產(chǎn)品質(zhì)量都有明確規(guī)定,。

1,、血清來源 ：可從世界各地收集胎牛血清，但必須符合其質(zhì)量標準和美國農(nóng)業(yè)部進口要求,。

2,、血清的收集：必須符合工業(yè)生產(chǎn)的標準，低溫采集,，一次分離,，分離后立即混合凍存。

3,、血清的制備：超低IgG胎牛血清,、透析血清、γ-射線輻照,；

4,、除菌過濾：0.22μm和0.1μm濾膜過濾；

5,、成品分裝：根據(jù)需要分裝成不同規(guī)格,。

五、牛血清的使用所產(chǎn)生的常見問題

（一）由于血清營養(yǎng)豐富,，貯存條件特殊,，因此在貯存和使用過程中容易產(chǎn)生以下問題：

1、改變培養(yǎng)液的pH值

牛血清的pH理論值為7.0～8.0,，培養(yǎng)基在加入規(guī)定量的碳酸氫鈉后（即達到細胞生長所需要的滲透壓），再加入10％的牛血清,，一般會使培養(yǎng)液的pH值發(fā)生改變,。因此在使用過程中應(yīng)注意pH的變化，如有必要可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)pH到所需值,。

2,、由于血清的營養(yǎng)成分豐富，非常適合細菌,、真菌和支原體等生長,。國產(chǎn)血清大部分采用手工分裝，因此容易把微生物帶入而使得血清被污染,。使用前如果沒有及時發(fā)現(xiàn),，將會把污染物帶入正在培養(yǎng)的細胞中，而使得細胞不能正常生長,。

3,、血清在貯存解凍過程中會產(chǎn)生沉淀,，這是由于血清中含有大量脂蛋白、纖維蛋白及多肽類物質(zhì),，在-15℃冷凍保存解凍后就會自然形成沉淀,，隨著保存時間的延長，沉淀量會增加,。因此在融化血清時一般應(yīng)先在4℃放置使之解凍,，然后放在室溫使血清*融化，以避免沉淀的增加,。添加血清時應(yīng)避免把沉淀加入培養(yǎng)液,，否則由于沉淀的存在會使得所培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生大量黑點，或者細胞表面將會覆蓋一層油狀物質(zhì),，影響細胞的正常生長,。為減少血清的損失，可以把有沉淀的血清收集起來進行離心處理,，將上清液加入培養(yǎng)液使用（一般不建議采用過濾的方法除去沉淀,，因為沉淀會堵塞濾膜而無法過濾）。

（二）大規(guī)模細胞培養(yǎng)中牛血清對細胞及病毒滴度的影響

血清是一種成分復(fù)雜的混合物,，不同批次血清對細胞生長的促進作用不同,。大規(guī)模細胞培養(yǎng)中由血清引起的細胞生長狀態(tài)不佳及病毒滴度的影響表現(xiàn)在以下幾個方面：

1、細胞生長速度緩慢,，長滿單層時間長,；從同一細胞瓶中分出兩瓶細胞，用同一種培養(yǎng)液,，分別加入10％的對照血清和待檢血清,，在相同條件下培養(yǎng)72小時，會出現(xiàn)對照血清長滿單層,，而待檢血清大約只有60～70％,，這種血清就不適合用來大規(guī)模培養(yǎng)細胞。

2,、細胞傳代后形態(tài)不正常,，細胞狀態(tài)發(fā)生變化 ；由于血清的質(zhì)量問題,，使原本狀態(tài)正常的細胞經(jīng)傳代后形態(tài)會變差,；比如：細胞瓶里會出現(xiàn)一些蠕動的小黑點（并非污染），或者細胞表面形成一層油狀覆蓋物,；細胞的輪廓變得模糊,，細胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充，從而影響細胞向四周擴展生長,。

3,、細胞傳幾代后就出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象,，不能連續(xù)傳代 ；質(zhì)量較差的血清缺乏某種細胞的貼壁因子,，會使細胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力,。細胞會從正常的貼壁狀態(tài)，邊緣開始萎縮,，上翹,。觀察到的現(xiàn)象就是細胞表面不光滑，晃動細胞瓶會看到細胞表面有絮狀物隨培養(yǎng)液波動,。隨著傳代次數(shù)增加,，細胞萎縮的情況越來越嚴重，直到zui終*脫壁而死亡,。

4,、細胞長的很好，致密的單層,，狀態(tài)也很正常,，但是接毒后細胞基本不發(fā)生病變，做滴度檢測幾乎測不出抗原滴度,。這種情況也許是因為血清中含有與接種的病毒有同源的特異性抗體,。比如血清中經(jīng)常會存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等,，如果存在這些抗體,，就會把接進去的病毒給中和掉。如果抗體滴度很高,，病毒會被抗體*中和,，就沒有病毒顆粒在細胞中增殖，所以會檢測不到病毒滴度,。這種情況給疫苗企業(yè)造成的損失是相當大的,，不產(chǎn)毒等于前面所做的那么多工作全部白費，浪費人力,、物力，尤其是時間上的浪費,，從培養(yǎng)細胞開始到接病毒,，到收液至少需要一兩個月，一旦出現(xiàn)不產(chǎn)毒的情況,，那么這一兩月時間就白白浪費掉了,，這也是牛血清給疫苗企業(yè)造成的風險之一。

5,、細胞生長的狀態(tài)一般,，產(chǎn)毒少,，毒價低。這種情況比較常見,，細胞是病毒的載體,，由于血清質(zhì)量不好，導(dǎo)致細胞生長狀態(tài)不好,，病毒就無法進行正常的復(fù)制,。并非所有病毒都不能復(fù)制，所以就造成疫苗的效價不夠,，可能造成不合格產(chǎn)品,。

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