在正常細(xì)胞中,，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡早期,，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè),。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合,。因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時,，膜磷脂酰絲氨酸外翻的發(fā)生早于細(xì)胞核的變化,，而此時Propidium Iodide（PI）不能通過細(xì)胞膜。

細(xì)胞壞死時,，雖然也會發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻,，但此時細(xì)胞膜的通透性明顯增加，PI等核酸染料進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞核中的核酸結(jié)合,，發(fā)出紅色熒光,。所以Annexin V-FITC(綠色熒光)常與鑒定細(xì)胞死活的核酸染料（如PI）合并使用，來區(qū)分凋亡細(xì)胞與死亡細(xì)胞,。

技術(shù)原理及步驟

1. 離心收集細(xì)胞,，微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000 rpm，離心時間5 min,，棄培養(yǎng)基,。

2. 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。

3. 用400 μL1× Binding Buffer懸浮細(xì)胞,，濃度大約為1×106 cells/mL,。

4. 在細(xì)胞懸浮液中加入5 μlLAnnexin V-FITC，輕輕混勻后于2~8°C避光條件下孵育15min,。

5. 加入10 μL PI后輕輕混勻于2~8°C避光條件下孵育5 min,。

6. 在1小時內(nèi)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測。

應(yīng)用實例

應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞的早期凋亡及區(qū)分凋亡與壞死細(xì)胞

服務(wù)周期

我公司在正式接受實驗委托2個星期左右完成實驗并提供實驗報告,。

客戶須知（對材料的要求,、注意事項）

需提供細(xì)胞類型,，處理條件。

慧穎生物專業(yè)血清10年,，我們不生產(chǎn)血清,，我們只是高品質(zhì)動物血清的搬運(yùn)工

血清是一種成分復(fù)雜的混合物，不同批次血清對細(xì)胞生長的促進(jìn)作用不同,。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中由血清引起的細(xì)胞生長狀態(tài)不佳及病毒滴度的影響表現(xiàn)在以下幾個方面：

1,、細(xì)胞生長速度緩慢，長滿單層時間長,；從同一細(xì)胞瓶中分出兩瓶細(xì)胞,，用同一種培養(yǎng)液，分別加入10％的對照血清和待檢血清,，在相同條件下培養(yǎng)72小時,，會出現(xiàn)對照血清長滿單層，而待檢血清大約只有60～70％,，這種血清就不適合用來大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞,。

2、細(xì)胞傳代后形態(tài)不正常,，細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生變化 ,；由于血清的質(zhì)量問題，使原本狀態(tài)正常的細(xì)胞經(jīng)傳代后形態(tài)會變差,；比如：細(xì)胞瓶里會出現(xiàn)一些蠕動的小黑點（并非污染）,，或者細(xì)胞表面形成一層油狀覆蓋物；細(xì)胞的輪廓變得模糊,，細(xì)胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充,，從而影響細(xì)胞向四周擴(kuò)展生長。

3,、細(xì)胞傳幾代后就出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象,，不能連續(xù)傳代 ；質(zhì)量較差的血清缺乏某種細(xì)胞的貼壁因子,，會使細(xì)胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力,。細(xì)胞會從正常的貼壁狀態(tài)，邊緣開始萎縮,，上翹,。觀察到的現(xiàn)象就是細(xì)胞表面不光滑，晃動細(xì)胞瓶會看到細(xì)胞表面有絮狀物隨培養(yǎng)液波動,。隨著傳代次數(shù)增加,，細(xì)胞萎縮的情況越來越嚴(yán)重，直到zui終*脫壁而死亡,。

4,、細(xì)胞長的很好,，致密的單層，狀態(tài)也很正常,，但是接毒后細(xì)胞基本不發(fā)生病變，做滴度檢測幾乎測不出抗原滴度,。這種情況也許是因為血清中含有與接種的病毒有同源的特異性抗體,。比如血清中經(jīng)常會存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等,，如果存在這些抗體,，就會把接進(jìn)去的病毒給中和掉。如果抗體滴度很高,，病毒會被抗體*中和,，就沒有病毒顆粒在細(xì)胞中增殖，所以會檢測不到病毒滴度,。這種情況給疫苗企業(yè)造成的損失是相當(dāng)大的,，不產(chǎn)毒等于前面所做的那么多工作全部白費(fèi)，浪費(fèi)人力,、物力,，尤其是時間上的浪費(fèi)，從培養(yǎng)細(xì)胞開始到接病毒,，到收液至少需要一兩個月,，一旦出現(xiàn)不產(chǎn)毒的情況，那么這一兩月時間就白白浪費(fèi)掉了,，這也是牛血清給疫苗企業(yè)造成的風(fēng)險之一,。

5、細(xì)胞生長的狀態(tài)一般,，產(chǎn)毒少,，毒價低。這種情況比較常見,，細(xì)胞是病毒的載體,，由于血清質(zhì)量不好，導(dǎo)致細(xì)胞生長狀態(tài)不好,，病毒就無法進(jìn)行正常的復(fù)制,。并非所有病毒都不能復(fù)制，所以就造成疫苗的效價不夠,，可能造成不合格產(chǎn)品,。

看來一款血清直接關(guān)系細(xì)胞的生死存亡，不用擔(dān)心,，慧穎提供無支原體,，低內(nèi)毒素和低血紅素的,，無反復(fù)凍融的高品質(zhì)26050-088血清

產(chǎn)品名稱    貨號    來源    規(guī)格    市場價格

胎牛血清FBS     10270-106   SOUTH AMERICA   500ML   3200

胎牛血清FBS     10270-106   SOUTH AMERICA   500ML   3200

胎牛血清FBS     c2027050    SOUTH AMERICA   500ML   2600

優(yōu)等胎牛血清FBS     10437-028   Mexico 500ML   3200

優(yōu)等胎牛血清FBS     10437-028   Mexico 500ML   3200

優(yōu)等胎牛血清FBS     10437-028   Mexico 500ML   3200

優(yōu)等胎牛血清FBS     10099-141   AUSTRALIA   500ML   7000

優(yōu)等胎牛血清FBS     10099-141   AUSTRALIA   500ML   7000

優(yōu)等胎牛血清FBS     10099-141   AUSTRALIA   500ML   7000

特級胎牛血清FBS     16000-044   USA 500ML   5800

特級胎牛血清FBS     16000-044   USA 500ML   5800

特級胎牛血清FBS 16000-044  USA 500ML   5800

優(yōu)等胎牛血清FBS 26140-079  USA 500ML   3600

優(yōu)等胎牛血清FBS     26140-079   USA 500ML   3600

熱滅活胎牛血清FBS  heat inactivated 10082-147  USA 500ML   5600

熱滅活胎牛血清FBS  heat inactivated     10100-147   AUSTRALIA   500ML   14239

熱滅活胎牛血清FBS  heat inactivated 10100-147  AUSTRALIA   500ML   14239

超低IgG胎牛血清Ultra-low IgG FBS   16250-078   USA 500ML   6000

透析胎牛血清Dialyzed FBS    264000-044  USA 500ML   6800

活性炭/葡聚糖處理胎牛血清Charcoal Stripped FBS  12676-029   USA 500Ml   6800

新生牛血清New born calf serum   16010159    New Zealand 500ML   1035

馬血清Horse Serum   16050-122   New Zealand 500ML   909

熱滅活馬血清Heat-Inactivated Horse Serum    26050-088  New Zealand 500Ml   1069