lncRNA 的研究已經(jīng)在世界范圍內(nèi)變得越愛(ài)越熱門(mén)，通過(guò)這些年的研究,，lncRNA的機(jī)制研究也形成了一定的套路：

1）高通量分析lncRNA的表達(dá),；

2）驗(yàn)證高通量篩選后的結(jié)果；

3）研究lncRNA與蛋白之間的相互作用,。

接下來(lái)的文章中,，慧穎生物會(huì)和大家一起討論lncRNA機(jī)制研究中常用的方法，歡迎小伙伴們積極參與討論,。

（一）高通量分析lncRNA 的表達(dá)

隨著lncRNA研究的不斷深入,，現(xiàn)在已經(jīng)有了很多很成熟的lncRNA芯片產(chǎn)品，可供選擇,。另外二代測(cè)序的興起,，也使得RNA-seq成為分析lncRNA表達(dá)譜的有效手段。當(dāng)然從費(fèi)用的角度講,，lncRNA 的芯片更便宜,，二代測(cè)序RNA-seq的成本更高。不過(guò)土豪請(qǐng)隨意,！

應(yīng)用lncRNA芯片或者RNA-seq進(jìn)行lncRNA表達(dá)譜分析的研究已經(jīng)有了很多,。例如，Orom等人在人類(lèi)的細(xì)胞系中通過(guò)lncRNA的芯片篩選,，鑒定了3019條lncRNA的表達(dá)分布,。另外，Ng等通過(guò)定制化的lncRNA芯片（customized microarray）研究了人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell,，hESCs）內(nèi)的lncRNA表達(dá)譜（expression profile）,。他們發(fā)現(xiàn)有一些胚胎干細(xì)胞特異性的lncRNA對(duì)于維持干細(xì)胞的多能性（pluripotency）有非常重要的作用。在腫瘤研究（乳腺癌,、胰腺癌,、肝癌等）中，lncRNA芯片的應(yīng)用也是非常地廣泛,。

相對(duì)于lncRNA芯片在表達(dá)譜研究方面的廣泛應(yīng)用,，RNA-seq方法的應(yīng)用領(lǐng)域則明顯地不同。RNA-seq 主要用于研究轉(zhuǎn)錄組,。應(yīng)用該方法,，獲得的結(jié)果受到的干擾信號(hào)（background signal）比較低，更重要的是,，通過(guò)RNA-seq有可能獲得全新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（當(dāng)然包括lncRNA在內(nèi),，但是不局限于lncRNA。例如在腫瘤研究中,，常用RNA-seq去發(fā)現(xiàn)新的融合基因,。利用RNA-seq技術(shù),，研究人員發(fā)現(xiàn)某些lncRNA分子在神經(jīng)精神疾病（neuropsychiatric disorder）中發(fā)揮重要作用,。另有研究者通過(guò)RNA-seq技術(shù),，分析了肝細(xì)胞癌（HCC）中的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，當(dāng)然也包括了lncRNA,。

（二）對(duì)于高通量數(shù)據(jù)的驗(yàn)證

常用的驗(yàn)證高通量數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)手段有：Northern blot,、qRT-PCR,、FISH及RNAi 等方式,。

目前zui為常用的檢測(cè)lncRNA表達(dá)的手段是qRT-PCR，它的操作簡(jiǎn)單,，自動(dòng)化程度高,，在實(shí)驗(yàn)室普遍使用。FISH的實(shí)驗(yàn)方法,，使用的實(shí)驗(yàn)室就相對(duì)較少,。FISH和Northern 類(lèi)似的地方是，它同樣是基于分子雜交的原理,。使用FISH的一大優(yōu)勢(shì)是,，它不僅可以表征lncRNA表達(dá)量的多少，更可以直觀(guān)地告訴研究者lncRNA在亞細(xì)胞/組織中的定位,。

研究者成功地使用該方法研究了多條lncRNA,，包括Xist、MALAT1,、MENε/β和Kcnq1ot1等,。RNAi是另一種廣泛使用的實(shí)驗(yàn)手段，在細(xì)胞中特異性地敲減lncRNA,，是檢測(cè)lncRNA功能時(shí),，zui常用的實(shí)驗(yàn)方法。例如,，HOTAIR的5'區(qū)域和3'區(qū)域可以分別結(jié)合PRC2和LSD1,，并起到一個(gè)腳手架（Scaffold）的作用。研究者通過(guò)RNAi的方式,，敲減細(xì)胞內(nèi)源性HOTAIR分子,，證實(shí)了該分子在結(jié)構(gòu)上的作用和功能。需要注意的是,，以上的多種方法可以相互結(jié)合,，以驗(yàn)證篩選獲得的lncRNA的表達(dá)及其可能發(fā)揮的功能。

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