家兔BMSC分離培養(yǎng)步驟 

1. 麻醉,、備皮、消毒,、鋪巾：取1只4-5周齡新西蘭幼兔,，速眠新肌肉注 射(0．1～0．2mL／kg)麻醉。仰臥固定于操作臺(tái)上,，褪毛,，備皮,，2%碘酒、75%酒精（或碘伏）常規(guī)消毒,，鋪洞巾(洞巾孔洞應(yīng)控制在lcm左右,，以利于減少污染)。 

2. 在雙側(cè)踝關(guān)節(jié)處環(huán)形剪開(kāi)皮膚,，再縱行剪開(kāi)皮膚至骶尾部,，分離肌肉、 筋膜等軟組織至見(jiàn)骨膜,，電鋸離斷踝關(guān)節(jié),、膝關(guān)節(jié)及髖關(guān)節(jié)，獲取家兔股骨和脛骨（橈骨）,置于裝有PBS液的無(wú)菌盒內(nèi),。（亦可從髂前上棘穿刺抽取骨髓） 

3．用PBS液體清洗骨組織3-4遍,，去除雜物、血跡后,，在超凈工作臺(tái)上,， 無(wú)菌條件下剝離骨周?chē)募∪廛浗M織，用眼科剪從股骨和脛骨的干骺端打開(kāi)骨髓腔,，用含有適量肝素( 625 U/mL)的DMEM 液沖洗骨髓腔,，收集沖洗液約 6 ～ 8 mL。吸管反復(fù)吹打后,，1 500 r/min,，離心5 min，棄上清,。加入 DMEM 培養(yǎng)基重懸,，將上述細(xì)胞重懸液按照 1∶ 1 的比例緩慢滴加到密度為 1. 073 g/mL 的PercoⅡ分離液中，1 500 r / min 離心 20 min,。離心后管內(nèi)容物分為 3 層,，收集中間乳白色云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層，加入 DMEM 培養(yǎng)液稀釋混勻,，1 500 r/min 離心 5 min,，洗滌 2 ～ 3 次，去除多余的脂肪細(xì)胞及組織液,。用含雙抗的 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，以 2. 0 × 10^5個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種于25cm^2培養(yǎng)瓶中，置于 37 ℃,，5%,、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

4. 48小時(shí)后半量換液,，去除浮物及其它非貼壁細(xì)胞（如造血干細(xì)胞）,，后每隔3天換液一次,。 

5. 7-10天后，待細(xì)胞融合長(zhǎng)滿(mǎn)至80%以上時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代,。 經(jīng)過(guò)*次傳代后,，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大約能占60%左右，并且呈漩渦狀生長(zhǎng),；一般經(jīng)過(guò)3次左右傳代后,，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大約能占90%左右,。