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家兔BMSC分離培養(yǎng)步驟
1. 麻醉,、備皮、消毒,、鋪巾:取1只4-5周齡新西蘭幼兔,,速眠新肌肉注 射(0.1~0.2mL/kg)麻醉。仰臥固定于操作臺(tái)上,,褪毛,,備皮,2%碘酒,、75%酒精(或碘伏)常規(guī)消毒,,鋪洞巾(洞巾孔洞應(yīng)控制在lcm左右,以利于減少污染),。
2. 在雙側(cè)踝關(guān)節(jié)處環(huán)形剪開(kāi)皮膚,,再縱行剪開(kāi)皮膚至骶尾部,分離肌肉,、 筋膜等軟組織至見(jiàn)骨膜,,電鋸離斷踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)及髖關(guān)節(jié),,獲取家兔股骨和脛骨(橈骨),置于裝有PBS液的無(wú)菌盒內(nèi),。(亦可從髂前上棘穿刺抽取骨髓)
3.用PBS液體清洗骨組織3-4遍,去除雜物,、血跡后,,在超凈工作臺(tái)上, 無(wú)菌條件下剝離骨周圍的肌肉軟組織,,用眼科剪從股骨和脛骨的干骺端打開(kāi)骨髓腔,,用含有適量肝素( 625 U/mL)的DMEM 液沖洗骨髓腔,收集沖洗液約 6 ~ 8 mL,。吸管反復(fù)吹打后,,1 500 r/min,離心5 min,,棄上清,。加入 DMEM 培養(yǎng)基重懸,將上述細(xì)胞重懸液按照 1∶ 1 的比例緩慢滴加到密度為 1. 073 g/mL 的PercoⅡ分離液中,,1 500 r / min 離心 20 min,。離心后管內(nèi)容物分為 3 層,收集中間乳白色云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層,,加入 DMEM 培養(yǎng)液稀釋混勻,1 500 r/min 離心 5 min,,洗滌 2 ~ 3 次,,去除多余的脂肪細(xì)胞及組織液,。用含雙抗的 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,以 2. 0 × 10^5個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種于25cm^2培養(yǎng)瓶中,,置于 37 ℃,,5%、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng),。
4. 48小時(shí)后半量換液,,去除浮物及其它非貼壁細(xì)胞(如造血干細(xì)胞),后每隔3天換液一次,。
5. 7-10天后,,待細(xì)胞融合長(zhǎng)滿至80%以上時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。 經(jīng)過(guò)*次傳代后,,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大約能占60%左右,,并且呈漩渦狀生長(zhǎng);一般經(jīng)過(guò)3次左右傳代后,,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大約能占90%左右,。
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