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家兔BMSC分離培養(yǎng)步驟

時間:2014-12-19閱讀:2129

家兔BMSC分離培養(yǎng)步驟 

1. 麻醉,、備皮、消毒,、鋪巾:取14-5周齡新西蘭幼兔,,速眠新肌肉注 (0102mLkg)麻醉。仰臥固定于操作臺上,褪毛,,備皮,,2%碘酒、75%酒精(或碘伏)常規(guī)消毒,,鋪洞巾(洞巾孔洞應控制在lcm左右,以利于減少污染),。 

 

2. 在雙側踝關節(jié)處環(huán)形剪開皮膚,,再縱行剪開皮膚至骶尾部,分離肌肉,、 筋膜等軟組織至見骨膜,,電鋸離斷踝關節(jié)、膝關節(jié)及髖關節(jié),,獲取家兔股骨和脛骨(橈骨),置于裝有PBS液的無菌盒內,。(亦可從髂前上棘穿刺抽取骨髓) 

 

3.用PBS液體清洗骨組織3-4遍,去除雜物,、血跡后,,在超凈工作臺上, 無菌條件下剝離骨周圍的肌肉軟組織,,用眼科剪從股骨和脛骨的干骺端打開骨髓腔,,用含有適量肝素( 625 U/mL)DMEM 液沖洗骨髓腔,收集沖洗液約 6 8 mL,。吸管反復吹打后,,1 500 r/min,離心5 min,,棄上清,。加入 DMEM 培養(yǎng)基重懸,將上述細胞重懸液按照 1 1 的比例緩慢滴加到密度為 1. 073 g/mL PercoⅡ分離液中,,1 500 r / min 離心 20 min,。離心后管內容物分為 3 層,收集中間乳白色云霧狀的單個核細胞層,,加入 DMEM 培養(yǎng)液稀釋混勻,,1 500 r/min 離心 5 min,洗滌 2 3 次,,去除多余的脂肪細胞及組織液,。用含雙抗的 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細胞,以 2. 0 × 10^5/cm2的細胞密度接種于25cm^2培養(yǎng)瓶中,,置于 37 ℃,,5%、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

 

4. 48小時后半量換液,,去除浮物及其它非貼壁細胞(如造血干細胞),,后每隔3天換液一次。 

 

5. 7-10天后,,待細胞融合長滿至80%以上時用0.25%胰蛋白酶消化傳代,。 經過*次傳代后,骨髓間充質干細胞大約能占60%左右,,并且呈漩渦狀生長,;一般經過3次左右傳代后,骨髓間充質干細胞大約能占90%左右,。

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