單克隆抗體的制備,、純化及鑒定

一,、實驗目的：

單克隆抗體制備是細胞免疫學的一個重要里程碑，它涵蓋了細胞培養(yǎng),、細胞融合,、免疫動物和抗體效價檢測等各個方面內(nèi)容。了解單克隆抗體制備的原理,、主要步驟和方法,。

二、實驗原理：

   骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)能大量無限增殖,，但不能分泌特異性抗體,；而抗原免疫的B淋巴細胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無限增殖,。將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞,，繼承了兩個親代細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無限制增殖的特性,，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗體的能力,。經(jīng)在HAT培養(yǎng)基[含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中進行選擇性培養(yǎng)，未融合的脾細胞因不能在體外長期存活而死亡,；未融合的骨髓瘤細胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷,，又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤完成DNA的合成過程而死亡,。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶,，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經(jīng)過克隆選擇,，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞,，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)，即可無限制地大量制備單克隆抗體,。

 三,、試劑與器材：

細胞培養(yǎng)板、解剖器械,、平皿,、酶標儀、加樣器,、細胞計數(shù)板、CO2培養(yǎng)箱,、倒置顯微鏡等,。

四、操作方法：

1,、抗原制備,；

一般而言，抗原的純度不很重要,，特別是免疫原性較強的抗原,。

A．可溶性抗原（蛋白質(zhì)） 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏*佐劑乳化，分多點小鼠皮下注射,，總量為0.3ml～0.6ml,，間隔３～５周再同樣注射一次,，１０天后,，斷尾取血一滴,，測抗體效價,，選滴度高的小鼠做融合試驗,。一個月后可以經(jīng)靜脈（尾靜脈）給予無佐劑抗原0.2ml～0.4ml,，３～４天后,，殺死小鼠取脾做融合用,。

B. 顆粒性抗原 如抗原來源方便,，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù),，縮短間隔時間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以１％濃度每只皮下注射０.２ml,，每周２次,，共免疫５～８次，取脾前３天,，再免疫一次即可,。有人認為zui后一次免疫劑量要大，大到近于免疫耐受的程度更好,。

2,、免疫動物；

目前應用zui廣的是小白鼠和大白鼠,，尤以小白鼠為好,。就品系而言以Balb/c小白鼠應用zui廣，因為所有的小白鼠骨髓瘤系均從Balb/c小白鼠系誘導出來,。Balb/c系小白鼠必須用純系的,，雌雄均可，以8~12周齡為宜,。

大白鼠也可,，能產(chǎn)生較多量的單克隆抗體。現(xiàn)在已經(jīng)在小鼠雜交瘤的基礎上,，發(fā)展了小鼠－大鼠,，小鼠－人以及人－人雜交瘤技術。

免疫程序,、劑量和方法是關系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關鍵之一,。

正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細胞，一只純種小白鼠估計能產(chǎn)生1.0×107~5.0×107種不同的抗體,。因此一只正常的小白鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤融合,，只能有千萬分之一的機會獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機會,，必須加強免疫,，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細胞大量增加。

B淋巴細胞的不同發(fā)育階段對獲得陽性雜交瘤也有很大影響,。有人認為處在轉化時期的B淋巴細胞可能更易于融合,，而免疫以后7~8天，雖然是抗體產(chǎn)生的高峰時期,，但形成有活力的雜交瘤細胞的可能反而減少,。故一般認為加強免疫后的第三天應殺鼠取脾做細胞融合。

3,、免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備,；

脾細胞制備

(1) 免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠,，拉頸或用CO₂處死小白鼠。

(2) 將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒,，取出固定于板上,，在無菌條件下取脾。

(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中,，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球,。

(4) 用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細胞懸液,，用毛細管將懸液移入小試管中,。

(5) 直立小試管3min，使大塊的結締組織下沉,，把細胞懸液移入離心管中,。

(6) 以2.5％FCS—1640充滿離心管，并以400g離心7min～10min（與此同時應開始制備骨髓細胞）,。

(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮,。

(8) 重復⑹、⑺步驟,。

(9) 計算細胞,，以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細胞數(shù)應高于80％為合格,。

骨髓瘤細胞制備

骨髓瘤細胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白,，這樣的瘤細胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度,，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞。

選擇骨髓瘤細胞的條件：①該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系,，以便兩者的組織相容性抗原一致,；②骨髓瘤細胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細胞外,；③骨髓瘤細胞生長需要一個較高的細胞密度,106個細胞/ml,；④生長速度快，繁殖時間短,。

目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細胞株有：①S194/5XXO·BU·1,；②SP2／0—Ag14（簡稱SP2）；③P2—X,？ ­—Ag8·6·5·3（簡稱653）,；④FO

以653zui為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane,，降植烷）誘發(fā)出來的一種漿細胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma,，MOPC）并經(jīng)過培育形成一株8-氮鳥嘌呤有抵抗力的亞系,。

骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中,，試驗時復蘇,、增殖、傳代即可,。由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態(tài),，很容易脫落，因此不需要胰酶處理,。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象,，在融合前，可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml 8－氮鳥嘌呤,。取約1×10⁷～6×10⁷對數(shù)生長期（即培養(yǎng)15h～20h）的骨髓瘤細胞,，在室溫離心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再懸浮并計數(shù),。

飼養(yǎng)細胞

在體外的細胞培養(yǎng)中,，單個的或數(shù)量很少的細胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細胞才能使其生長繁殖,，加入的細胞稱之為飼養(yǎng)細胞（Feeder cell）,。在細胞融合和單克隆的選擇過程中，就是在少量的或單個細胞的基礎上使其生長繁殖成群體,，因此在這一過程中必須使用飼養(yǎng)細胞,。許多種類的動物細胞都可以做飼養(yǎng)細胞，如正常的脾細胞,、胸腺細胞,、腹腔滲出細胞等，常選用腹腔滲出細胞,，其中主要是巨噬細胞和淋巴細胞,。應用腹腔滲出細胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細胞，另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細胞和細胞碎片,，為融合細胞的生長造成良好的環(huán)境,。腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠,，如C57鼠,，昆明小白鼠等。

（1）拉頸處死小鼠,。

（2）70％酒精浸泡消毒10min,。

（3）用手術剪將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚,，露出腹腔,。

（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔,，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管,。

（5）1 000r／min離心10min,。

（6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細胞制成懸液,。臺盼藍染色計數(shù)活細胞,，使每毫升含40萬個活細胞。

（7）以1ml吸管將細胞種入微量培養(yǎng)皿,，每孔0.05ml,，含2萬個細胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),，即可供細胞融合和克隆化之用,。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細胞數(shù)量少，則可以在細胞換液時再加入一些,。

4,、細胞融合；

小鼠骨髓瘤可以在體外培養(yǎng)液中生存并大量繁殖,。經(jīng)過用某種抗原免疫的小鼠及淋巴細胞能分泌某種抗體,，但小鼠的B淋巴細胞在一般培養(yǎng)某中不易存活。

如將小鼠的骨髓瘤細胞與分泌霜種抗體的B淋巴細胞在融合因子（聚乙二醇,，PEG）作用下產(chǎn)生融合,，則融合的細胞既具有腫瘤細胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴細胞分泌特異性抗體的能力,，在HAT選擇培養(yǎng)基中可以選擇得到雜交細胞,。這種融合的被稱為淋巴細胞雜交瘤的細胞可以在體外培養(yǎng)液中大量繁殖生長，從培養(yǎng)液上清中可以收集到大量某B淋巴細胞產(chǎn)物——單克隆抗體,。

（1）,、取末次免疫后的第3天小鼠脾細胞懸液，將108小鼠脾細胞與1-5×107SO2/O小鼠骨髓瘤細胞混合于50毫升刻度離心管中,，經(jīng)1000轉/分離心7分鐘；

（2）,、棄上清液,，盡可能除得干凈，用手指輕叩離心管底部,，使沉淀混勻如糊狀,，離心管置37℃水中進行水浴（一小燒杯中）,，準備融合,；

3）,、將37℃水浴中保溫的50%PEG1.0毫升（實際應用0.7毫升）用滴管緩慢滴入離心管中，在60秒鐘內(nèi)滴完,，在37℃水浴中邊滴邊搖邊離心管,，使細胞保存在混勻狀態(tài)；

4）,、加完PEG后,，將細胞懸液放在37℃水浴中靜置90秒鐘，立即在2—4分鐘內(nèi)加入15毫升無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（37℃）,，開始要一滴一滴地加,，由于稀釋使PEG停止作用。注意盡可能不攪動細胞,；

5）,、再經(jīng)100轉/分離心10分鐘。棄去上清液,，加25毫升HAT培養(yǎng)液,，輕輕混勻，將混懸液分裝已有巨噬細胞的兩個24孔培養(yǎng)板中,，每孔0.5毫升,；

6）、將培養(yǎng)板放在水蒸汽飽和CO2孵箱中,，37℃孵育,。CO2含量為5%；

7）,、每2—3天換一次HAT培養(yǎng)液,，連續(xù)2周觀察雜交瘤細胞是否出現(xiàn)。2周后使用HT培養(yǎng)基,。

5,、雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)；

6,、雜交瘤細胞的篩選,；

7、雜交瘤細胞的克隆化,；

8,、單克隆抗體的檢定；

9,、分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立,；

10、單克隆抗體的大量制備,。

五,、關鍵步驟與注意事項：

1,、整個制備過程需嚴格無菌

2、細胞傳代培養(yǎng)時注意適時更換培養(yǎng)液

雜交瘤細胞的大量繁殖

克隆化的細胞可以在體外進行大量培養(yǎng),，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體,。不過體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細胞濃度,，且每天要換培養(yǎng)液,。而體內(nèi)雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細胞具有從親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性,。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠）,，雜交瘤細胞就開始無限地繁殖，直至宿主死亡,。產(chǎn)生腫瘤細胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體,，這種抗體的效價往往高于培養(yǎng)細胞上清液的100~1 000倍。

利用免疫抑制劑,，如降植烷,、液體石蠟、抗淋巴細胞血清等,，可以加速和促進腫瘤的生長,。

1．材料

　　（1）經(jīng)高壓滅菌的降植烷,。

　?。?）Balb/c鼠：5~8周齡。

（3）雜交瘤細胞：取對數(shù)生長期的細胞,。

（4）RPMI—1640培養(yǎng)液

（5）新生牛血清

2．操作方法

　　(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,，注射后１～９周內(nèi)種植細胞。

　　(2) 收取對數(shù)生長期的雜交瘤細胞,，用５％FCS—1640液洗滌一次,，1 000r/min離心10min。

(3) 取樣,，用臺盼蘭染色,，計活細胞數(shù)，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107細胞/ml的懸液,。

(4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細胞,，每只腹腔注射1ml（含1.0×107個細胞/ml）。

(5) 接種后10天左右時間腫瘤體積zui大,，此時可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次,，可取10次,。血清可由腋下動脈或心臟采血后分離,。

單克隆抗體的提純

1．材料

(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

20 mMol/L NaCl

(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

40mMol/L NaCl

(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

80 mMol/L NaCl

(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

(5) 飽和硫酸銨液

(6) DEAE—纖維素柱

2．操作方法

（1）小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00×105轉離心30min,，去沉淀,。

（2）在4℃于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌,，使溶液zui終為50％硫酸銨濃度,。

（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min離心10min,，去上清,。

（4）將沉淀溶于Tris－HCl緩沖液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混濁）。

（5）裝入透析袋于Tris－HCl緩沖液（20 mMol/L NaCl）中透析除鹽,。

（6）離心去沉淀,。

（7）溶液稀釋（1:100或更高倍稀釋）后，于280nm測蛋白含量,，估計蛋白質(zhì)含量

1A 280unit=0.8mg蛋白質(zhì)

一般每ml腹水中,，含有總蛋白約25mg~36mg。

（8）過DEAE—纖維素柱：纖維素柱高40cm,，以20mMol/L NaCl Tris緩沖液平衡,。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。

樣品進入柱床速度為1ml~2ml/min,，以NaCl線形梯度洗脫,。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫，也有極少例外的單克隆抗體于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脫,。

測OD280nm收集蛋白峰,，單克隆IgG保存?zhèn)溆谩?/span>

雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM,，究竟是哪種為主,，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次,，且3天后就取脾,，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細胞,。免疫多次的多為IgG,。

單克隆抗體的鑒定

1．雜交瘤細胞染色體的檢查 采用秋水仙素裂解法進行。

2．單克隆抗體的類型,、亞型的測定：購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標準抗血清,，采用瓊脂擴散法或ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型。

3．單抗的特異性鑒定 可以采用各種方法，如免疫熒光法,、ELISA法,、間接血凝和免疫印跡技術等，同時還需做免疫阻斷試驗等,。

4．單抗的效價測定 可采用凝集反應,、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價不同,。培養(yǎng)上清液的效價遠不如腹水的效價,。采用凝集反應，腹水效價可達5×104,。而采用ELISA檢查,，腹水效價可達1.0×106。單抗的效價以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示,。

5．必要時還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定,。

動物的選擇

目前應用zui廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好,。就品系而言以Balb/c小白鼠應用zui廣,，因為所有的小白鼠骨髓瘤系均從Balb/c小白鼠系誘導出來。Balb/c系小白鼠必須用純系的,，雌雄均可,，以8~12周齡為宜。

大白鼠也可,，能產(chǎn)生較多量的單克隆抗體?，F(xiàn)在已經(jīng)在小鼠雜交瘤的基礎上，發(fā)展了小鼠－大鼠,，小鼠－人以及人－人雜交瘤技術,。

免疫

一般而言，抗原的純度不很重要,，特別是免疫原性較強的抗原,。

免疫程序、劑量和方法是關系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關鍵之一,。

正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細胞,，一只純種小白鼠估計能產(chǎn)生1.0×10⁷~5.0×10⁷種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤融合,，只能有千萬分之一的機會獲得某一種特定抗體,。所以為了提高得到某種雜交瘤的機會，必須加強免疫,，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細胞大量增加,。

B淋巴細胞的不同發(fā)育階段對獲得陽性雜交瘤也有很大影響,。有人認為處在轉化時期的B淋巴細胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天,，雖然是抗體產(chǎn)生的高峰時期,，但形成有活力的雜交瘤細胞的可能反而減少。故一般認為加強免疫后的第三天應殺鼠取脾做細胞融合,。

1．可溶性抗原（蛋白質(zhì)） 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏*佐劑乳化，分多點小鼠皮下注射,，總量為0.3ml～0.6ml,，間隔３～５周再同樣注射一次，１０天后,，斷尾取血一滴,，測抗體效價，選滴度高的小鼠做融合試驗,。一個月后可以經(jīng)靜脈（尾靜脈）給予無佐劑抗原0.2ml～0.4ml,，３～４天后，殺死小鼠取脾做融合用,。

２.顆粒性抗原 如抗原來源方便,，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時間,。例如用羊紅血球免疫小白鼠,，以１％濃度每只皮下注射０.２ml，每周２次,，共免疫５～８次,，取脾前３天，再免疫一次即可,。有人認為zui后一次免疫劑量要大,，大到近于免疫耐受的程度更好。

單克隆抗體技術：細胞的選擇

脾細胞

1．材料

(1) 免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠,。

(2) 1640培養(yǎng)液

(3) 2.5％FCS－1640營養(yǎng)液

2．操作方法

(1) 拉頸或用CO2處死小白鼠,。

(2) 將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上,，在無菌條件下取脾,。

(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球,。

(4) 用鑷子輕輕擠壓脾,，做成脾細胞懸液，用毛細管將懸液移入小試管中,。

(5) 直立小試管3min,，使大塊的結締組織下沉，把細胞懸液移入離心管中。

(6) 以2.5％FCS—1640充滿離心管,，并以400g離心7min～10min（與此同時應開始制備骨髓細胞）,。

(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。

(8) 重復⑹,、⑺步驟,。

(9) 計算細胞，以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查,，活細胞數(shù)應高于80％為合格,。

骨髓瘤細胞

骨髓瘤細胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細胞融合后,，可能影響或降低所分泌抗體的滴度,，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞。

選擇骨髓瘤細胞的條件：①該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系,，以便兩者的組織相容性抗原一致,；②骨髓瘤細胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細胞外,；③骨髓瘤細胞生長需要一個較高的細胞密度,106個細胞/ml,；④生長速度快，繁殖時間短,。

目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細胞株有：①S194/5XXO·BU·1,；②SP2／0—Ag14（簡稱SP2）；③P2—X,？ ­—Ag8·6·5·3（簡稱653）,；④FO

以653zui為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane,，降植烷）誘發(fā)出來的一種漿細胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma,，MOPC）并經(jīng)過培育形成一株8-氮鳥嘌呤有抵抗力的亞系。

骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入,，保存于-195℃液氮罐中,，試驗時復蘇、增殖,、傳代即可,。

由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落,，因此不需要胰酶處理,。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前,，可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml 8－氮鳥嘌呤,。取約1×107～6×107對數(shù)生長期（即培養(yǎng)15h～20h）的骨髓瘤細胞,，在室溫離心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再懸浮并計數(shù),。

飼養(yǎng)細胞

在體外的細胞培養(yǎng)中,，單個的或數(shù)量很少的細胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細胞才能使其生長繁殖,，加入的細胞稱之為飼養(yǎng)細胞（Feeder cell）,。在細胞融合和單克隆的選擇過程中，就是在少量的或單個細胞的基礎上使其生長繁殖成群體,，因此在這一過程中必須使用飼養(yǎng)細胞,。許多種類的動物細胞都可以做飼養(yǎng)細胞，如正常的脾細胞,、胸腺細胞、腹腔滲出細胞等,，常選用腹腔滲出細胞,，其中主要是巨噬細胞和淋巴細胞。應用腹腔滲出細胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細胞,，另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細胞和細胞碎片,，為融合細胞的生長造成良好的環(huán)境。腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同系鼠,。也可以是其他種類的小鼠,，如C57鼠，昆明小白鼠等,。

1．材料

（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只,。

（2）11.6％蔗糖溶液（經(jīng)10磅30min高壓滅菌）。

2．操作方法

（1）拉頸處死小鼠,。

（2）70％酒精浸泡消毒10min,。

（3）用手術剪將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚,，露出腹腔,。

（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體,，加入離心管,。

（5）1 000r／min離心10min。

（6）取上清,，以HAT選擇培養(yǎng)液將細胞制成懸液,。臺盼藍染色計數(shù)活細胞，使每毫升含40萬個活細胞,。

（7）以1ml吸管將細胞種入微量培養(yǎng)皿,，每孔0.05ml,，含2萬個細胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),，即可供細胞融合和克隆化之用,。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細胞數(shù)量少，則可以在細胞換液時再加入一些,。

單克隆抗體技術：抗體檢測

用檢測抗體的方法從雜交細胞中篩選出生產(chǎn)抗體的雜交株是很重要的,。檢測抗體的方法很多，從沉淀反應到放射免疫測定,。由于細胞培養(yǎng)液中的抗體濃度通常是很低的,，而且傳統(tǒng)的檢測方法多是以多價抗原與多克隆抗血清相反應。雜交瘤產(chǎn)生的抗體則是單克隆的,，所以并不是每項方法都能適用,。一定要選擇敏感的、快速的,、一次又能檢測多份樣品的方法,。常用的檢測方法如下：

１．試管溶血反應檢測法

（1）材料：①雜交瘤細胞，換液后至少兩天才收取培養(yǎng)液,；②綿羊紅血球,，洗滌三次后，配成1％懸液,；③豚鼠補體,，無菌采取補體，以pH7.2PBS稀釋成20％溶液,，分裝小瓶,，于﹣40℃保存。使用時以補體和壓積紅血球5:1（V/V）的量進行吸收,，4℃30min,，然后2 000r/min離心10min，去紅血球,，取上清液備用,；④0.01Mol/L pH7.2PBS液。

（2）操作方法：①在小試管中,，加入0.1ml雜交瘤細胞用過的培養(yǎng)液,，再加入0.1ml pH7.2的PBS液，然后倍比稀釋至一定的稀釋度,；②加入0.1ml補體和1％綿羊紅血球0.1ml,，混勻后置37℃水浴1h；③觀察結果,，以綿羊紅血球*溶解的雜交瘤細胞培養(yǎng)液的zui高稀釋倍數(shù)為抗體的溶血效價,。

2．斑點檢測法 抗紅血球表面的單克隆抗體與澆灌在瓊脂板的紅血球結合,，進而結合補體，而發(fā)生溶血斑點,，對著光源用肉眼即可判定,。

（1）材料：①綿羊紅血球，處理同試管法,，zui后配成25％紅血球懸液,；②新鮮豚鼠血清（同試管法處理）；③瓊脂糖,，配成0.6％PBS液,，水浴中溶化；④0.01Mol/L pH7.2PBS液,；⑤兔抗羊紅血球抗體,。

（2）操作方法：①將溶化的0.6％瓊脂糖倒入一試管中，置45℃～48℃水浴中,；②加0.1ml 25％紅血球懸液,，0.1ml豚鼠補體，迅速混勻,，傾注一干凈載玻片上；③ 凝固后,，在凝膠表面固定區(qū)域滴加2ml待測樣品,，標準陽性血清和對照試液；④待溶液全部滲入凝膠后,，置濕盤,；⑤37℃溫育1h～2h，觀察并判定結果,。

強陽性（ ） 中等陽性（ ）

弱陽性（ ） 陰性（﹣）

必要時可置室溫一夜,，再判定一次。

3．膜熒光檢測法

（1）材料：①培養(yǎng)液HEM或RPMI－1640,；②熒光試劑：異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗小鼠免疫球蛋白,；③50％甘油緩沖液：1份甘油加1份體積0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成；④熒光顯微鏡,、載玻片,、蓋玻片、吸管等,。

（2）操作方法：①用培養(yǎng)液洗滌二次細胞,，懸浮成2.0×107／ml；②50µl細胞懸液加50μl培養(yǎng)上清液混合,，置4℃30min,，用培養(yǎng)液洗滌3次,，1 000r/min離心；③以50µlFITC—抗小鼠免疫球蛋白重新懸浮壓積細胞,，水浴30min～60min,；④用冷培養(yǎng)液洗3次細胞，重新懸??；⑤取一滴細胞懸液滴在玻片上，復蓋片,，用甘油緩沖液封固,，置熒光顯微鏡下觀察。著色細胞也可以在固定后觀察,，一滴細胞懸液,，涂片、風干,，用95％酒精固定10min,，固定后的載玻片用PBS洗滌，蓋上蓋玻片,，進行觀察,。

4．免疫球蛋白和亞類球蛋白的檢測 以瓊脂雙擴散試驗法進行，此法簡單易操作,，特異性好,。注意必須將培養(yǎng)液濃縮10～50倍，否則做雙向瓊擴不出現(xiàn)沉淀線,。其檢測方法為：

（1）制備各種兔抗小鼠IgG1~4,、 IgM1~2、IgA1~2和K,、λ抗血清,也可直接購買,。

（2）取5ml培養(yǎng)物的上清液緩慢加入0.5ml的飽和硫酸銨溶液，混勻,，靜置3h,，離心沉淀，去上清,，沉淀加0.05ml蒸餾水溶解,。

（3）制成1％瓊脂糖凝膠板，打孔,。中間孔加20μl濃縮上清液,，周圍孔加20µl特異性抗血清，以10μl正常小鼠血清作對照,。

也可以采用酶聯(lián)免疫吸附試驗,、間接血凝試驗以及放射免疫等方法檢測,。

單克隆抗體的制備

雜交瘤細胞的大量繁殖

克隆化的細胞可以在體外進行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體,。不過體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限,，其不能超過特定的細胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液,。而體內(nèi)雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制,。雜交瘤細胞具有從親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠）,，雜交瘤細胞就開始無限地繁殖,，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體,，這種抗體的效價往往高于培養(yǎng)細胞上清液的100~1 000倍,。

利用免疫抑制劑，如降植烷,、液體石蠟,、抗淋巴細胞血清等，可以加速和促進腫瘤的生長,。

1．材料

　?。?）經(jīng)高壓滅菌的降植烷。

　?。?）Balb/c鼠：5~8周齡,。

（3）雜交瘤細胞：取對數(shù)生長期的細胞。

（4）RPMI—1640培養(yǎng)液

（5）新生牛血清

2．操作方法

　　(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,，注射后１～９周內(nèi)種植細胞。

　　(2) 收取對數(shù)生長期的雜交瘤細胞,，用５％FCS—1640液洗滌一次,，1 000r/min離心10min。

(3) 取樣,，用臺盼蘭染色,，計活細胞數(shù)，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107細胞/ml的懸液,。

(4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細胞,，每只腹腔注射1ml（含1.0×107個細胞/ml）。

(5) 接種后10天左右時間腫瘤體積zui大,，此時可由腹腔抽取腹水,，每隔1~3天取1次，可取10次,。血清可由腋下動脈或心臟采血后分離,。

單克隆抗體的提純

1．材料

(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

20 mMol/L NaCl

(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

40mMol/L NaCl

(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

80 mMol/L NaCl

(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

(5) 飽和硫酸銨液

(6) DEAE—纖維素柱

2．操作方法

（1）小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后,，于1.00×105轉離心30min，去沉淀,。

（2）在4℃于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液,，邊加邊攪拌，使溶液zui終為50％硫酸銨濃度,。

（3）此溶液置冰中30min~60min,，然后5 000r/min離心10min，去上清,。

（4）將沉淀溶于Tris－HCl緩沖液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混濁）,。

（5）裝入透析袋于Tris－HCl緩沖液（20 mMol/L NaCl）中透析除鹽。

（6）離心去沉淀,。

（7）溶液稀釋（1:100或更高倍稀釋）后,，于280nm測蛋白含量，估計蛋白質(zhì)含量

1A 280unit=0.8mg蛋白質(zhì)

一般每ml腹水中,，含有總蛋白約25mg~36mg,。

（8）過DEAE—纖維素柱：纖維素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris緩沖液平衡,。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋,。

樣品進入柱床速度為1ml~2ml/min，以NaCl線形梯度洗脫,。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫,，也有極少例外的單克隆抗體于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脫。

測OD280nm收集蛋白峰,，單克隆IgG保存?zhèn)溆谩?/span>

雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白,，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主,，則決定于抗原的免疫程序,。免疫一次，且3天后就取脾,，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細胞,。免疫多次的多為IgG。

單克隆抗體的鑒定

1．雜交瘤細胞染色體的檢查 采用秋水仙素裂解法進行,。

2．單克隆抗體的類型,、亞型的測定：購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標準抗血清，采用瓊脂擴散法或ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型,。

3．單抗的特異性鑒定 可以采用各種方法,，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術等,，同時還需做免疫阻斷試驗等,。

4．單抗的效價測定 可采用凝集反應、ELISA或放射免疫測定,。不同的測定方法效價不同,。培養(yǎng)上清液的效價遠不如腹水的效價。采用凝集反應,，腹水效價可達5×104,。而采用ELISA檢查，腹水效價可達1.0×106,。單抗的效價以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示,。

5．必要時還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定。

單克隆抗體技術：克隆化經(jīng)過抗體測定的陽性孔,，可以擴大培養(yǎng),，進行克隆，以得到單個細胞的后代分泌單克隆抗體,?？寺〉臅r間一般說來越早越好。因為在這個時期各種雜交瘤細胞同時旺盛生長,，互相爭奪營養(yǎng)和空間,，而產(chǎn)生抗體的細胞有被淹沒和淘汰的可能。但克隆時間也不宜太早,，太早細胞性狀不穩(wěn)定,，數(shù)量少也易丟失。

克隆化的陽性雜交瘤細胞,，經(jīng)過一段時期培養(yǎng)之后,，也還會因為細胞突變或特定染色體的丟失，使部分細胞喪失產(chǎn)生抗體的能力,，所以需要再次或多次克隆化培養(yǎng),。克隆化次數(shù)的多少由分泌能力強弱和抗原的免疫性強弱而決定,。一般說，免疫性強的抗原克隆次數(shù)可少一些,，但至少要3～5次克隆才能穩(wěn)定,。

克隆化的方法很多，包括有限稀釋法,、顯微操作法,、軟瓊脂平板法及熒光激活分離法等。

有限稀釋法

1．材料

（1）微量培養(yǎng)盤，盤內(nèi)各孔于克隆化前一天培養(yǎng)小鼠腹腔細胞（即飼養(yǎng)細胞）每孔2萬～4萬,。

（2）HT培養(yǎng)基

2．操作方法

（1）取出抗體陽性孔細胞,，用HT培養(yǎng)液制成細胞懸液。并取樣進行臺盼蘭染色,，計數(shù),。

（2）用HT培養(yǎng)液將細胞稀釋成200個/ml、40個/ml,、20個/ml和的懸液,。

（3）用吸管將細胞懸液分別種入微量培養(yǎng)盤，每孔0.05ml,，細胞含量分別為10個/孔,、2個/孔、1個/孔和0.5個/孔,。

（4）5％CO2飽和濕度,，37℃培養(yǎng)。

（5）每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況,，選擇只有一個集落生長的孔,，棄掉兩個以上和沒有細胞生長的孔。

（6）克隆大量繁殖后,，布滿孔底的1/3～1/2時,，測培養(yǎng)液抗體。

（7）抗體陽性孔細胞,，移到有飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)瓶中,，并傳2～4代就可以脫離飼養(yǎng)細胞，建成克隆株