小鼠IL-23 ELISA試劑盒使用說明書

                      上海慧穎生物科技有限公司

本試劑盒僅供研究使用

預期應用

ELISA法定量測定小鼠血清,、血漿,、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關液體中IL-23含量。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中IL-23水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入IL-23抗原,、生物素化的抗小鼠IL-23抗體,、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-23呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2. 標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為10000 pg/mL,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10000 pg/mL,，5000 pg/mL ,，2500 pg/mL，1250 pg/mL,，625 pg/mL,，312.5 pg/mL，156 pg/mL,，其原液直接作為zui高標準濃度,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制5000 pg/mL標準品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

1. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。
2. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。
3. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
4. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制。
5. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。
6. 底物溶液：1×10ml/瓶。
7. 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
8. 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標本的采集及保存

1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標本保存于-20℃,，且應避免反復凍融。

2．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃一夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存，但應避免反復凍融,。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融,。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫,。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，輕輕混勻，酶標板加上蓋,，37℃反應120分鐘,。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌,。
3. 每孔加檢測溶液A工作液 100ul,，37℃,60分鐘。洗板3次,，350ul/每孔，甩干,。
4. 每孔加檢測溶液B工作液 100ul,，37℃，60分鐘,，洗板5次,，甩干。
5. 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯）。
6. 依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）,。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。

2．為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠IL-23,，且與其它相關蛋白無交叉反應,。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。
2. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。
3. 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔。
4. 如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標準品,、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制，不能混淆,。

6．底物請避光保存,。

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

5．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準,。