RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液的配制  

1. 配制培養(yǎng)基使用新制備的三蒸水。一般在試驗前當(dāng)天或前一天制備為好,。調(diào)節(jié)pH值的酸堿溶液也應(yīng)該使用這種水配制,。

2. 制備培養(yǎng)基的器皿清洗要干凈，烤干后備用（濾器,、濾膜,、量筒、移液管及盛放培養(yǎng)基的小瓶等存放和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基液體的器具都應(yīng)進(jìn)行滅菌）,。

3. 溶解培養(yǎng)基：將干粉培養(yǎng)基溶于總量1/3的水中,，再用水洗包裝袋內(nèi)面兩次，倒入培養(yǎng)液中,。振蕩或超聲助溶,，一般不要加熱助溶。

4. 補(bǔ)加試劑：根據(jù)包裝袋說明和試驗需要加入NaHCO3（2.0g）,、谷氨酰胺,、丙酮酸鈉、HEPES等其他試劑,。 

5. 加抗生素：一般抗生素終濃度為――青霉素100U/ml,，鏈霉素100U/ml,。市售青霉素為80萬U／瓶，可溶于4ml體積,，每一升培養(yǎng)液中加0.5ml即可,。市售鏈霉素為100萬U／瓶，可溶于5ml體積,，每一升培養(yǎng)液中也加0.5ml即可,。無鏈霉素的情況下，用慶大霉素代替,，終濃度調(diào)為50～200U/ml,。

6. 調(diào)pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情況下），然后用5％ NaHCO3 調(diào)節(jié)pH到7.2,。 

7. 過濾除菌：宜采用0.45um和0.22um濾膜各一張,，上層為0.45um，下層為0.22um,，以保證過濾效果,。注意濾膜正面（光面）朝上。過濾后分裝于小瓶中（100或200ml）,。

8. 加小牛血清：根據(jù)培養(yǎng)基配制的量將小牛血清分裝,，冷凍保存（－20℃）。臨用前將加入小牛血清(10%~20%),。 

【注意事項】  每次配液時,，需要的其他輔助性液體（Hanks，胰蛋白酶消化液,，PBS,，抗生素溶液等）也可以同時配制，分別過濾,。  市售小牛血清使用前都應(yīng)該滅活（56℃,，30min），以消除補(bǔ)體活性,。動物血清個體差異大,，故而每一批血清都進(jìn)行嚴(yán)格檢測，同時進(jìn)行無菌試驗,。血清應(yīng)該為淡黃色,，透明，無溶血,，無沉淀,，滅活后顏色稍深。生化檢測總蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g／100ml,。選定一個效果較好的批號后,，可一次多購該批號的血清，保證試驗條件的穩(wěn)定,。  由于市售小牛血清pH未知,，但大多偏酸。試驗中加入小牛血清后,，培養(yǎng)基的pH可能還會變化,，故亦可先加入小牛血清后調(diào)pH值。但此種方法過濾較困難,，只適于正壓過濾,。  培養(yǎng)液配好后，應(yīng)先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi),，于37℃溫箱內(nèi)置24～48hr,，以檢測培養(yǎng)液是否有污染。  每次配液量以兩周左右為宜,，一次配液不要太多，防止?fàn)I養(yǎng)成分（主要為谷氨酰胺）損失,，造成實驗繁瑣或者污染,。 

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM的配制（初學(xué)）  2010.07.02  細(xì)胞培養(yǎng)基是由合成培養(yǎng)和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售,，它是根據(jù)細(xì)胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì),。其主要成分是氨基酸、纖維素,、碳水化合物,、無機(jī)離子和其它輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細(xì)胞外液相似,。小牛血清含有一定的營養(yǎng)成分,，更重要的是它含有細(xì)胞生長所必須的生長因子、激素,、貼附因子等,，這是合成培養(yǎng)基無法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性,。故一般體外培養(yǎng)細(xì)胞時要加入一定量的小牛血清（１0%）,。

【儀器、材料和試劑】

1．儀器：蠕動泵1套,，濾器,，高壓蒸汽滅菌鍋，磁力攪拌器，pH計,。

2．材料：3000mL錐形瓶,，250mL或500mL培養(yǎng)液瓶，0.22mm的微孔濾膜,。

3．試劑：雙蒸水,，小牛血清，合成培養(yǎng)基（DMEM）,，NaHCO3,。

【操作步驟】 

1．過濾器的準(zhǔn)備和安裝

（1）清洗好過濾器，干燥 

（2）將一張0.22mm的微孔濾膜在DDW中浸泡后放入濾器,，注意不要有氣泡,。

（3）用布或報紙包裝好，121℃ 30min進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理,。

（4）在超凈臺內(nèi)安裝好過濾裝置,，準(zhǔn)備過濾。

2．合成培養(yǎng)基的配制 DMEM    13.5g NaHCO3     3.7g       HEPES   2.38g DDW溶解  10M的NaOH調(diào)pH為7.5   定容1L 

(1)將干粉型培養(yǎng)基DMED溶于300ml的三蒸水中,，再用300ml水沖洗包裝內(nèi)面兩次,，倒入培養(yǎng)液中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液,。 

(2)加入NaHCO3 3.7g  HEPES   2.38g,。磁力攪拌器攪拌。*溶解即可,，不易在空氣中攪拌過長時間,，大量的CO2融入會影響培養(yǎng)基的pH

（3）正常情況下用10M的NaOH調(diào)pH為7.5。

（4）過濾除菌,。于超凈臺中濾器過濾,。 

（5）濾前、濾后分別取10ml的培養(yǎng)基于15ml的離心管中,，置37℃ 24h,，檢測是否無菌。 

（6）檢測無污染后,，2℃－8℃下避光保存,。  

（7）使用時加入加抗生素：zui終濃度青霉素為100U/ml，鏈霉素100μg/ml,。一般市售青霉素為80萬U/瓶,，將其溶解在4ml體積內(nèi)，每1000ml培養(yǎng)液中加0.5ml,，即成zui終濃度為100U/ml,。市售鏈霉素為100萬U/瓶,，將其溶解5ml體積內(nèi)，也是每1000ml加0.5ml,，使其zui終濃度為100μg/ml,。

（8）加入小牛血清  市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理,，即通過加熱的方法破壞補(bǔ)體,。  將血清放入56℃水浴中30min，其間要不時輕輕晃動,，使受熱均勻,，防止沉淀析出。根據(jù)培養(yǎng)基量加入小牛血清,，使其終濃度為10%,。  每次配液量以使用兩周左右的量為宜。一次配液不要太多,，一是營養(yǎng)成分有損失,，二是容易污染。