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貼壁細(xì)胞消化傳代中常見問題
貼壁細(xì)胞消化傳代時通常采用兩種方法:
一、加入胰酶等細(xì)胞脫落后,,再加培養(yǎng)基中止胰酶作用,,離心傳代;
二,、加入胰酶后,,鏡下觀察待細(xì)胞始脫落時,棄胰酶,,加培養(yǎng)液分瓶,。但前者太麻煩,而后者有可能對細(xì)胞施加胰酶選擇,,因為總是貼壁不牢的細(xì)胞先脫落,,對腫瘤細(xì)胞來說,這部分細(xì)胞有可能是惡性程度較高的細(xì)胞亞群,。
介紹一種簡單的消化傳代方法和各位共享,。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用(30s),棄之,,再加入適量胰酶作用10s-40s(根據(jù)細(xì)胞消化的難易程度),,棄之,這樣依賴殘余的胰酶就可將細(xì)胞消化單細(xì)胞,。
1,、洗去血清
2、加1/5V PBS/D-Hank‘s,,2到3次
3,、1/10V 胰酶
4、鏡下觀察,,見突起縮回(細(xì)胞間隙增大)即加含血清培液
5,、吹打后(加培液)
6、分種
對于較難消化的細(xì)胞,,可以用2%利多卡因消化5-8分鐘,,然后再棄去,加培養(yǎng)基吹打也可以,,對細(xì)胞的影響不大,。
1、棄去舊培養(yǎng)液,,PBS或D液清洗2-3遍(除去舊培養(yǎng)液中血清的影響),;
2、加入0.125% (0.25%也可以) 胰酶6滴(25cm2的培養(yǎng)瓶),,使胰酶剛剛可以布滿整個底,; 3,、作用1min左右,用含10%血清的培養(yǎng)液3-5ml中和;
4,、輕柔吹打細(xì)胞脫壁, 離心,。
贊同不用PBS也不用Hanks洗,只要把舊培養(yǎng)液吸的干凈一點,,直接加酶消化應(yīng)該不會有什么問題,。
對付難消化細(xì)胞的做法是棄取培養(yǎng)液后,用0.04%的EDTA沖洗一次,,再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min,,棄取大部分EDTA,加入與剩余EDTA等量的胰酶(預(yù)熱)總體積1/10v,。消化到有細(xì)胞脫落,。不過有人說EDTA對細(xì)胞不好。
EDTA對細(xì)胞有損傷作用,,一般在難消化的細(xì)胞才和胰酶合用,,用了EDTA后把細(xì)胞離心后洗幾遍洗去EDTA。
首先,,EDTA對細(xì)胞肯定有傷害,,EDTA可以與細(xì)胞膜上很多大分子蛋白上的中金屬成分發(fā)生螯合,致使蛋白變性影響蛋白質(zhì)的生物活性而發(fā)生損傷,。
但是,,這種損傷是可逆的。就細(xì)胞傳代所用的濃度和時間條件下,,還不致對細(xì)胞產(chǎn)生過大影響,。其實Hyclone的胰酶中就有EDTA。
因此在一般細(xì)胞操作中不能用TE代替PBS洗細(xì)胞,。
培養(yǎng)的BASMC:倒掉舊培養(yǎng)液,,加入少量胰酶沖一下,倒掉,,再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml(25ml bottle)消化,,再加入適量新培養(yǎng)基中和,并分瓶 這種方法簡單,、省事,;效果很好并且不損失細(xì)胞!
問題1: 我的細(xì)胞消化要用EDTA加胰酶消化20分鐘,,有什么好辦法,?
解答1: 先用PBS把細(xì)胞洗兩遍,使瓶內(nèi)沒有血清了,,減少對胰酶的中和,,然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右,放在37度,,然后可以在細(xì)胞有些消化下來時,,拿著瓶口,運(yùn)用手腕的力量輕輕震蕩瓶內(nèi)液體,,這樣細(xì)胞很快就下來了,,還不需要吹打,分散也均勻
問題2: 消化細(xì)胞后都用什么洗滌呀,?帶血清的PBS,,還是直接用PBS,或者是用培養(yǎng)液呀,?我原代培養(yǎng)的細(xì)胞二次接種后總是有些細(xì)胞鋪不開,,有些又鋪很好,不知是什么問題,,求教一下
解答2: 不管是進(jìn)口血清或是國產(chǎn)血清,,都用PBS直接沖洗三次即可,沒有必要用DMEM或加血清的培養(yǎng)液,。見意你查查胰酶消化的原理,,本論壇中就有,加了血清胰酶怎么消化呀,。
細(xì)胞鋪不開,,原因有二:
一是消化時離心管中的細(xì)胞沒有吹打開,解決方法是離心后的細(xì)胞加3ml左右的培養(yǎng)基,,用吸管輕輕吹打,,吹打開后,再加培養(yǎng)基,,這樣細(xì)胞不會成團(tuán),,培養(yǎng)基太多,細(xì)胞不容易吹打開,。二是接種時,,培養(yǎng)瓶中先加培養(yǎng)基,再接種細(xì)胞,,接種后輕輕晃動搖勻,。先加細(xì)胞后加培養(yǎng)基或不晃動搖勻,其結(jié)果就是細(xì)胞鋪不開,。
養(yǎng)MSCs,,傳代時候胰酶消化過后,用加血清的培養(yǎng)液終止消化,,再離心,。棄上清夜,,再加入含血清培養(yǎng)液,重懸浮細(xì)胞,,吹打均勻,,計數(shù),安所需密度接種,。先用少量培養(yǎng)液,,比如1到2ml,潤濕培養(yǎng)瓶,,然后再接種細(xì)胞原因是如果直接接種細(xì)胞的話,,肯定有的地方接觸了較多培養(yǎng)液,而有的地方幾乎就沒有培養(yǎng)液,,細(xì)胞當(dāng)然不會在沒有營養(yǎng)的地方待著了,。
總之,先用少量培養(yǎng)液潤濕應(yīng)該是一個解決辦法,。
我們的觀點為:
1,、不洗的細(xì)胞傳代后,次日一般要換液一次,,除去沒有貼壁的死細(xì)胞.如果是懸浮生長的細(xì)胞則不用處理,。
2、用離心洗滌來出去殘留胰酶是不必要的,,增加污染機(jī)會,,也造成細(xì)胞丟失,還會使些一些細(xì)胞死亡,。
問題3: 以前一直養(yǎng)懸浮細(xì)胞,,現(xiàn)在養(yǎng)貼壁細(xì)胞,總感覺消化時間老是把握不好,,有時候消化過頭了,,損失很多細(xì)胞;有時又消化不充分,,導(dǎo)致吹打時候困難,,懇請各位給予指點!
解答3: 消化時間和細(xì)胞類型,、消化液的消化能力,、細(xì)胞的密度等多種因素有關(guān)。一般養(yǎng)一種新的細(xì)胞要摸索一下消化時間,,掌握細(xì)胞消化到什么程度恰到好處,。新配的消化液消化能力較強(qiáng),配好后可分裝成小管,,一次用完,,其余凍在-20℃,,以保持酶活力。消化液只需鋪滿瓶底即可,,可放入培養(yǎng)箱中,,因外在37℃時酶的活力高于常溫,,有利于縮短消化時間,。還有一種方法,就是將胰酶鋪滿瓶底后,,輕搖培養(yǎng)瓶,,使胰酶與細(xì)胞充分解除,然后倒掉大部分胰酶,,利用剩余的少量胰酶再消化一段時間,,待細(xì)胞間空隙增大,瓶底呈花斑狀即可,。細(xì)胞生長到覆蓋70~80%瓶底時消化較好,,若細(xì)胞密度過大則消化后細(xì)胞易成團(tuán)。
消化時間不應(yīng)超過5分鐘,,否則對細(xì)胞損害很大,。消化液覆蓋細(xì)胞,成一薄膜,,然后反復(fù)傾斜,,使消化液沖刷細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞收縮,,部分細(xì)胞脫落時,,可用*培養(yǎng)基馬上中和,同時吹打壁上細(xì)胞,。應(yīng)該沒問題,。 消化的時間不能一概而倫,要看你的細(xì)胞的種類,,即使同一種細(xì)胞,,在不同的細(xì)胞株也回出現(xiàn)消化的時間不同的現(xiàn)象,象我們實驗室以前的VERO細(xì)胞就很好消化,,一般就是2-3分鐘左右,,現(xiàn)在重新拿了一株新的VERO細(xì)胞平均每次消化在5分鐘以上;其次要看你配的胰酶的質(zhì)量,,如果配的比較好,,消化的時候就要好消化一點,反之就久一點,。還要在你看到消化過頭的情況下,,如果細(xì)胞下來的比較多了,,這時你把CMF或PBS連同細(xì)胞棄去是很浪費(fèi)的,你還不如就連同CMF或PBS加上營養(yǎng)液一起傳,,因為營養(yǎng)液中有血清,,胰酶一遇到血清就會自動終止消化,當(dāng)然這樣對你的細(xì)胞是有一定的影響的,,但是這也是補(bǔ)救的*方法,,我消化過頭的時候都是這樣處理的,只要你的血清質(zhì)量夠好,,細(xì)胞一般都會張的較好,。
問題4: 本人用胰酶冷消化細(xì)胞后,終止消化后,,發(fā)現(xiàn)絮狀的組織細(xì)胞怎么也吹不散,,都不容易移入培養(yǎng)瓶。是為什么呢,?
解答4: 我們實驗室使用胰酶消化細(xì)胞時胰酶并不預(yù)熱,,而是直接從4攝氏度冰箱中取出在室溫中直接使用,對消化效果影響不大,。不過我想可能有幾個原因:
其一:細(xì)胞生長過度,,也就是在有限的空間里面細(xì)胞數(shù)量太多,相同時間內(nèi)消化進(jìn)行不徹
底,,導(dǎo)致大量細(xì)胞間連接沒有破壞掉,。
其二:消化時間不夠。
其三:樓上所說的情況我還沒有經(jīng)歷過,,可能也存在吧,。不過我想應(yīng)該取決于樓主用胰酶消化的細(xì)胞的性質(zhì)。
在培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC-3M時也遇到過類似問題,。當(dāng)時是準(zhǔn)備做流式,,看藥物對細(xì)胞周期和調(diào)亡的影響。首先排除了藥物對細(xì)胞的影響,,后來發(fā)現(xiàn)可能是由于細(xì)胞屬高度轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系,,貼壁不牢,常規(guī)消化會破壞細(xì)胞膜,,出現(xiàn)非常難吹散的白色絮狀物,。于是嘗試了以下兩種方法:1、加入消化液使其撲滿瓶底后迅速將其倒出,,縮短消化時間,。2、不使用消化液,用培養(yǎng)液直接將貼壁細(xì)胞吹打下來,。此法會造成細(xì)胞丟失,,但*避免了消化液消化過度的影響,在細(xì)胞量較大時可嘗試,。此外,,還在文獻(xiàn)上看到常規(guī)消化后,加入含血清的PBS洗細(xì)胞,,終止殘存消化液的作用,,我沒有親自嘗試過。
其實冷消化和熱消化都無所謂,,當(dāng)然一般熱消化會比冷消化要好一點,,因為胰酶在加熱時活性高一些,,這取決于你的細(xì)胞.出現(xiàn)絮狀物可能是你的細(xì)胞破碎后DNA釋放造成,,你可以試用DNase把它裂解掉.我也曾遇見過類似情況,加DNase就沒有了.當(dāng)然也可能是其它原因,,你可以摸索一下.DNase使用濃度一般20-30u/ml,,你可以在配胰酶時直接加到胰酶中.
問題5: 我培養(yǎng)的是卵巢癌患者腹水中提取的原代腫瘤細(xì)胞,現(xiàn)在已經(jīng)鋪滿瓶底,。今晚消化傳代時,,發(fā)現(xiàn)用胰酶后消化15分鐘,也只有少部分細(xì)胞變圓飄起,,大部分細(xì)胞稍有皺縮,,但是貼壁還是很勞。吹打也掉不下來,。 我的胰酶是3-28配的,,配好后一直放在4度冰箱。是不是胰酶失效了,?還是原代細(xì)胞就是難消化,?
回答5: 胰酶配好分裝后,置-20度備用,,使用之前37水浴溶解,,25cm2的培養(yǎng)瓶用2ml的胰酶,所以分裝時,,盡量考慮到每次的用量,,一次拿出來就用完。避免胰酶反復(fù)凍融超,,易失效,。
胰酶消化時,要在37度培養(yǎng)箱內(nèi),一般0.25%胰酶2~3分鐘,,0.05%胰酶-EDTA 3~5分鐘,,貼壁細(xì)胞即可*飄起。
像你這種情況,,估計是胰酶失效,,3月28到今天4月17日,你只是把胰酶放在4度保存,,時間和溫度都不合適,。 也有一種可能性:生長狀態(tài)不好的細(xì)胞,消化時間也會延長,。但我們還沒有消化超過5分鐘還不能work的情況,。
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