貼壁細(xì)胞消化傳代中常見(jiàn)問(wèn)題

貼壁細(xì)胞消化傳代時(shí)通常采用兩種方法：

一、加入胰酶等細(xì)胞脫落后，再加培養(yǎng)基中止胰酶作用,，離心傳代,；

二、加入胰酶后,，鏡下觀察待細(xì)胞始脫落時(shí),，棄胰酶，加培養(yǎng)液分瓶,。但前者太麻煩,，而后者有可能對(duì)細(xì)胞施加胰酶選擇，因?yàn)榭偸琴N壁不牢的細(xì)胞先脫落,，對(duì)腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō),，這部分細(xì)胞有可能是惡性程度較高的細(xì)胞亞群。

 介紹一種簡(jiǎn)單的消化傳代方法和各位共享,。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s）,，棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據(jù)細(xì)胞消化的難易程度）,，棄之,，這樣依賴殘余的胰酶就可將細(xì)胞消化單細(xì)胞。

 1,、洗去血清 

 2,、加1/5V PBS/D-Hank‘s，2到3次

 3,、1/10V 胰酶  

4,、鏡下觀察，見(jiàn)突起縮回（細(xì)胞間隙增大）即加含血清培液 

5,、吹打后（加培液）

6、分種   

對(duì)于較難消化的細(xì)胞,，可以用2%利多卡因消化5-8分鐘,，然后再棄去，加培養(yǎng)基吹打也可以,，對(duì)細(xì)胞的影響不大,。  

1、棄去舊培養(yǎng)液,，PBS或D液清洗2－3遍（除去舊培養(yǎng)液中血清的影響）,； 

2、加入0.125% (0.25%也可以) 胰酶6滴（25cm2的培養(yǎng)瓶）,，使胰酶剛剛可以布滿整個(gè)底,；  3、作用1min左右,用含10%血清的培養(yǎng)液3-5ml中和,； 

4,、輕柔吹打細(xì)胞脫壁, 離心,。

贊同不用PBS也不用Hanks洗，只要把舊培養(yǎng)液吸的干凈一點(diǎn),，直接加酶消化應(yīng)該不會(huì)有什么問(wèn)題,。  

對(duì)付難消化細(xì)胞的做法是棄取培養(yǎng)液后，用0.04%的EDTA沖洗一次,，再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min,，棄取大部分EDTA，加入與剩余EDTA等量的胰酶（預(yù)熱）總體積1/10v,。消化到有細(xì)胞脫落,。不過(guò)有人說(shuō)EDTA對(duì)細(xì)胞不好。

 EDTA對(duì)細(xì)胞有損傷作用,，一般在難消化的細(xì)胞才和胰酶合用,，用了EDTA后把細(xì)胞離心后洗幾遍洗去EDTA。 

 首先,，EDTA對(duì)細(xì)胞肯定有傷害,，EDTA可以與細(xì)胞膜上很多大分子蛋白上的中金屬成分發(fā)生螯合，致使蛋白變性影響蛋白質(zhì)的生物活性而發(fā)生損傷,。         

 但是,，這種損傷是可逆的。就細(xì)胞傳代所用的濃度和時(shí)間條件下,，還不致對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)大影響,。其實(shí)Hyclone的胰酶中就有EDTA。          

因此在一般細(xì)胞操作中不能用TE代替PBS洗細(xì)胞,。                         

培養(yǎng)的BASMC：倒掉舊培養(yǎng)液,，加入少量胰酶沖一下，倒掉,，再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml（25ml bottle）消化,，再加入適量新培養(yǎng)基中和，并分瓶 這種方法簡(jiǎn)單,、省事,；效果很好并且不損失細(xì)胞！ 

問(wèn)題1：  我的細(xì)胞消化要用EDTA加胰酶消化20分鐘,，有什么好辦法,？ 

解答1：  先用PBS把細(xì)胞洗兩遍，使瓶?jī)?nèi)沒(méi)有血清了,，減少對(duì)胰酶的中和,，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在細(xì)胞有些消化下來(lái)時(shí),，拿著瓶口,，運(yùn)用手腕的力量輕輕震蕩瓶?jī)?nèi)液體，這樣細(xì)胞很快就下來(lái)了,，還不需要吹打,，分散也均勻 

問(wèn)題2：  消化細(xì)胞后都用什么洗滌呀？帶血清的PBS,，還是直接用PBS,，或者是用培養(yǎng)液呀？我原代培養(yǎng)的細(xì)胞二次接種后總是有些細(xì)胞鋪不開(kāi),，有些又鋪很好,，不知是什么問(wèn)題，求教一下 

解答2：  不管是進(jìn)口血清或是國(guó)產(chǎn)血清,，都用PBS直接沖洗三次即可,，沒(méi)有必要用DMEM或加血清的培養(yǎng)液。見(jiàn)意你查查胰酶消化的原理,，本論壇中就有,，加了血清胰酶怎么消化呀。                   

細(xì)胞鋪不開(kāi),，原因有二：

一是消化時(shí)離心管中的細(xì)胞沒(méi)有吹打開(kāi),，解決方法是離心后的細(xì)胞加3ml左右的培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打,，吹打開(kāi)后,，再加培養(yǎng)基，這樣細(xì)胞不會(huì)成團(tuán),，培養(yǎng)基太多,，細(xì)胞不容易吹打開(kāi)。二是接種時(shí),，培養(yǎng)瓶中先加培養(yǎng)基,，再接種細(xì)胞，接種后輕輕晃動(dòng)搖勻,。先加細(xì)胞后加培養(yǎng)基或不晃動(dòng)搖勻，其結(jié)果就是細(xì)胞鋪不開(kāi),。          

養(yǎng)MSCs,，傳代時(shí)候胰酶消化過(guò)后，用加血清的培養(yǎng)液終止消化,，再離心,。棄上清夜，再加入含血清培養(yǎng)液，重懸浮細(xì)胞,，吹打均勻,，計(jì)數(shù)，安所需密度接種,。先用少量培養(yǎng)液,，比如1到2ml，潤(rùn)濕培養(yǎng)瓶,，然后再接種細(xì)胞原因是如果直接接種細(xì)胞的話,，肯定有的地方接觸了較多培養(yǎng)液，而有的地方幾乎就沒(méi)有培養(yǎng)液,，細(xì)胞當(dāng)然不會(huì)在沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)的地方待著了,。         

總之，先用少量培養(yǎng)液潤(rùn)濕應(yīng)該是一個(gè)解決辦法,。 

我們的觀點(diǎn)為：   

1,、不洗的細(xì)胞傳代后，次日一般要換液一次,，除去沒(méi)有貼壁的死細(xì)胞．如果是懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則不用處理,。 

 2、用離心洗滌來(lái)出去殘留胰酶是不必要的,，增加污染機(jī)會(huì),，也造成細(xì)胞丟失，還會(huì)使些一些細(xì)胞死亡,。 

   問(wèn)題3：  以前一直養(yǎng)懸浮細(xì)胞,，現(xiàn)在養(yǎng)貼壁細(xì)胞，總感覺(jué)消化時(shí)間老是把握不好,，有時(shí)候消化過(guò)頭了,，損失很多細(xì)胞；有時(shí)又消化不充分,，導(dǎo)致吹打時(shí)候困難,，懇請(qǐng)各位給予指點(diǎn)！ 

   解答3：  消化時(shí)間和細(xì)胞類型,、消化液的消化能力,、細(xì)胞的密度等多種因素有關(guān)。一般養(yǎng)一種新的細(xì)胞要摸索一下消化時(shí)間,，掌握細(xì)胞消化到什么程度恰到好處,。新配的消化液消化能力較強(qiáng)，配好后可分裝成小管,，一次用完,，其余凍在－20℃,，以保持酶活力。消化液只需鋪滿瓶底即可,，可放入培養(yǎng)箱中,，因外在37℃時(shí)酶的活力高于常溫，有利于縮短消化時(shí)間,。還有一種方法,，就是將胰酶鋪滿瓶底后，輕搖培養(yǎng)瓶,，使胰酶與細(xì)胞充分解除,，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間,，待細(xì)胞間空隙增大,，瓶底呈花斑狀即可。細(xì)胞生長(zhǎng)到覆蓋70～80％瓶底時(shí)消化較好,，若細(xì)胞密度過(guò)大則消化后細(xì)胞易成團(tuán),。

     消化時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘，否則對(duì)細(xì)胞損害很大,。消化液覆蓋細(xì)胞,，成一薄膜，然后反復(fù)傾斜,，使消化液沖刷細(xì)胞,，當(dāng)細(xì)胞收縮，部分細(xì)胞脫落時(shí),，可用*培養(yǎng)基馬上中和,，同時(shí)吹打壁上細(xì)胞。應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題,。 消化的時(shí)間不能一概而倫,，要看你的細(xì)胞的種類，即使同一種細(xì)胞,，在不同的細(xì)胞株也回出現(xiàn)消化的時(shí)間不同的現(xiàn)象,，象我們實(shí)驗(yàn)室以前的VERO細(xì)胞就很好消化，一般就是2-3分鐘左右,，現(xiàn)在重新拿了一株新的VERO細(xì)胞平均每次消化在5分鐘以上,；其次要看你配的胰酶的質(zhì)量，如果配的比較好,，消化的時(shí)候就要好消化一點(diǎn),，反之就久一點(diǎn)。還要在你看到消化過(guò)頭的情況下,，如果細(xì)胞下來(lái)的比較多了,，這時(shí)你把CMF或PBS連同細(xì)胞棄去是很浪費(fèi)的，你還不如就連同CMF或PBS加上營(yíng)養(yǎng)液一起傳,，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)液中有血清,，胰酶一遇到血清就會(huì)自動(dòng)終止消化，當(dāng)然這樣對(duì)你的細(xì)胞是有一定的影響的,，但是這也是補(bǔ)救的*方法,，我消化過(guò)頭的時(shí)候都是這樣處理的，只要你的血清質(zhì)量夠好,，細(xì)胞一般都會(huì)張的較好,。 

   問(wèn)題4：  本人用胰酶冷消化細(xì)胞后，終止消化后,，發(fā)現(xiàn)絮狀的組織細(xì)胞怎么也吹不散,，都不容易移入培養(yǎng)瓶。是為什么呢,？ 

   解答4：  我們實(shí)驗(yàn)室使用胰酶消化細(xì)胞時(shí)胰酶并不預(yù)熱,，而是直接從4攝氏度冰箱中取出在室溫中直接使用，對(duì)消化效果影響不大,。不過(guò)我想可能有幾個(gè)原因：          

其一：細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度,，也就是在有限的空間里面細(xì)胞數(shù)量太多，相同時(shí)間內(nèi)消化進(jìn)行不徹

底,，導(dǎo)致大量細(xì)胞間連接沒(méi)有破壞掉,。          

其二：消化時(shí)間不夠。          

其三：樓上所說(shuō)的情況我還沒(méi)有經(jīng)歷過(guò),，可能也存在吧,。不過(guò)我想應(yīng)該取決于樓主用胰酶消化的細(xì)胞的性質(zhì)。          

在培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC-3M時(shí)也遇到過(guò)類似問(wèn)題,。當(dāng)時(shí)是準(zhǔn)備做流式,，看藥物對(duì)細(xì)胞周期和調(diào)亡的影響。首先排除了藥物對(duì)細(xì)胞的影響,，后來(lái)發(fā)現(xiàn)可能是由于細(xì)胞屬高度轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系,，貼壁不牢，常規(guī)消化會(huì)破壞細(xì)胞膜,，出現(xiàn)非常難吹散的白色絮狀物,。于是嘗試了以下兩種方法：1、加入消化液使其撲滿瓶底后迅速將其倒出,，縮短消化時(shí)間,。2、不使用消化液,，用培養(yǎng)液直接將貼壁細(xì)胞吹打下來(lái),。此法會(huì)造成細(xì)胞丟失,，但*避免了消化液消化過(guò)度的影響，在細(xì)胞量較大時(shí)可嘗試,。此外,，還在文獻(xiàn)上看到常規(guī)消化后，加入含血清的PBS洗細(xì)胞,，終止殘存消化液的作用,，我沒(méi)有親自嘗試過(guò)。          

其實(shí)冷消化和熱消化都無(wú)所謂,，當(dāng)然一般熱消化會(huì)比冷消化要好一點(diǎn),，因?yàn)橐让冈诩訜釙r(shí)活性高一些，這取決于你的細(xì)胞．出現(xiàn)絮狀物可能是你的細(xì)胞破碎后DNA釋放造成,，你可以試用ＤＮａｓｅ把它裂解掉．我也曾遇見(jiàn)過(guò)類似情況,，加ＤＮａｓｅ就沒(méi)有了．當(dāng)然也可能是其它原因，你可以摸索一下．ＤＮａｓｅ使用濃度一般２０－３０ｕ／ｍｌ,，你可以在配胰酶時(shí)直接加到胰酶中． 

   問(wèn)題5：  我培養(yǎng)的是卵巢癌患者腹水中提取的原代腫瘤細(xì)胞,，現(xiàn)在已經(jīng)鋪滿瓶底。今晚消化傳代時(shí),，發(fā)現(xiàn)用胰酶后消化15分鐘,，也只有少部分細(xì)胞變圓飄起，大部分細(xì)胞稍有皺縮,，但是貼壁還是很勞,。吹打也掉不下來(lái)。   我的胰酶是3－28配的,，配好后一直放在4度冰箱,。是不是胰酶失效了？還是原代細(xì)胞就是難消化,？

   回答5：  胰酶配好分裝后,，置－20度備用，使用之前37水浴溶解,，25cm2的培養(yǎng)瓶用2ml的胰酶,，所以分裝時(shí)，盡量考慮到每次的用量,，一次拿出來(lái)就用完,。避免胰酶反復(fù)凍融超，易失效,。       

 胰酶消化時(shí),，要在37度培養(yǎng)箱內(nèi)，一般0.25％胰酶2～3分鐘,，0.05％胰酶－EDTA 3～5分鐘,，貼壁細(xì)胞即可*飄起,。          

像你這種情況，估計(jì)是胰酶失效,，3月28到今天4月17日,，你只是把胰酶放在4度保存，時(shí)間和溫度都不合適,。   也有一種可能性：生長(zhǎng)狀態(tài)不好的細(xì)胞，消化時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng),。但我們還沒(méi)有消化超過(guò)5分鐘還不能work的情況,。