貼壁細(xì)胞消化傳代中常見問題

貼壁細(xì)胞消化傳代時通常采用兩種方法：

一、加入胰酶等細(xì)胞脫落后,，再加培養(yǎng)基中止胰酶作用,，離心傳代；

二,、加入胰酶后,，鏡下觀察待細(xì)胞始脫落時，棄胰酶,，加培養(yǎng)液分瓶,。但前者太麻煩，而后者有可能對細(xì)胞施加胰酶選擇,，因為總是貼壁不牢的細(xì)胞先脫落,，對腫瘤細(xì)胞來說，這部分細(xì)胞有可能是惡性程度較高的細(xì)胞亞群,。

 介紹一種簡單的消化傳代方法和各位共享,。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s），棄之,，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據(jù)細(xì)胞消化的難易程度）,，棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將細(xì)胞消化單細(xì)胞,。

 1,、洗去血清 

 2、加1/5V PBS/D-Hank‘s,，2到3次

 3,、1/10V 胰酶  

4、鏡下觀察,，見突起縮回（細(xì)胞間隙增大）即加含血清培液 

5,、吹打后（加培液）

6、分種   

對于較難消化的細(xì)胞,，可以用2%利多卡因消化5-8分鐘,，然后再棄去，加培養(yǎng)基吹打也可以,，對細(xì)胞的影響不大,。  

1、棄去舊培養(yǎng)液,，PBS或D液清洗2－3遍（除去舊培養(yǎng)液中血清的影響）,； 

2、加入0.125% (0.25%也可以) 胰酶6滴（25cm2的培養(yǎng)瓶）,，使胰酶剛剛可以布滿整個底,；  3,、作用1min左右,用含10%血清的培養(yǎng)液3-5ml中和； 

4,、輕柔吹打細(xì)胞脫壁, 離心,。

贊同不用PBS也不用Hanks洗，只要把舊培養(yǎng)液吸的干凈一點,，直接加酶消化應(yīng)該不會有什么問題,。  

對付難消化細(xì)胞的做法是棄取培養(yǎng)液后，用0.04%的EDTA沖洗一次,，再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min,，棄取大部分EDTA，加入與剩余EDTA等量的胰酶（預(yù)熱）總體積1/10v,。消化到有細(xì)胞脫落,。不過有人說EDTA對細(xì)胞不好。

 EDTA對細(xì)胞有損傷作用,，一般在難消化的細(xì)胞才和胰酶合用,，用了EDTA后把細(xì)胞離心后洗幾遍洗去EDTA。 

 首先,，EDTA對細(xì)胞肯定有傷害,，EDTA可以與細(xì)胞膜上很多大分子蛋白上的中金屬成分發(fā)生螯合，致使蛋白變性影響蛋白質(zhì)的生物活性而發(fā)生損傷,。         

 但是,，這種損傷是可逆的。就細(xì)胞傳代所用的濃度和時間條件下,，還不致對細(xì)胞產(chǎn)生過大影響,。其實Hyclone的胰酶中就有EDTA。          

因此在一般細(xì)胞操作中不能用TE代替PBS洗細(xì)胞,。                         

培養(yǎng)的BASMC：倒掉舊培養(yǎng)液,，加入少量胰酶沖一下，倒掉,，再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml（25ml bottle）消化,，再加入適量新培養(yǎng)基中和，并分瓶 這種方法簡單,、省事,；效果很好并且不損失細(xì)胞！ 

問題1：  我的細(xì)胞消化要用EDTA加胰酶消化20分鐘,，有什么好辦法,？ 

解答1：  先用PBS把細(xì)胞洗兩遍，使瓶內(nèi)沒有血清了,，減少對胰酶的中和,，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度,，然后可以在細(xì)胞有些消化下來時,，拿著瓶口，運(yùn)用手腕的力量輕輕震蕩瓶內(nèi)液體,，這樣細(xì)胞很快就下來了,，還不需要吹打，分散也均勻 

問題2：  消化細(xì)胞后都用什么洗滌呀,？帶血清的PBS,，還是直接用PBS，或者是用培養(yǎng)液呀,？我原代培養(yǎng)的細(xì)胞二次接種后總是有些細(xì)胞鋪不開,，有些又鋪很好，不知是什么問題,，求教一下 

解答2：  不管是進(jìn)口血清或是國產(chǎn)血清,，都用PBS直接沖洗三次即可，沒有必要用DMEM或加血清的培養(yǎng)液,。見意你查查胰酶消化的原理,，本論壇中就有，加了血清胰酶怎么消化呀,。                   

細(xì)胞鋪不開,，原因有二：

一是消化時離心管中的細(xì)胞沒有吹打開，解決方法是離心后的細(xì)胞加3ml左右的培養(yǎng)基,，用吸管輕輕吹打,，吹打開后，再加培養(yǎng)基,，這樣細(xì)胞不會成團(tuán),，培養(yǎng)基太多，細(xì)胞不容易吹打開,。二是接種時,，培養(yǎng)瓶中先加培養(yǎng)基，再接種細(xì)胞,，接種后輕輕晃動搖勻,。先加細(xì)胞后加培養(yǎng)基或不晃動搖勻，其結(jié)果就是細(xì)胞鋪不開,。          

養(yǎng)MSCs,，傳代時候胰酶消化過后，用加血清的培養(yǎng)液終止消化,，再離心,。棄上清夜,，再加入含血清培養(yǎng)液，重懸浮細(xì)胞,，吹打均勻,，計數(shù)，安所需密度接種,。先用少量培養(yǎng)液,，比如1到2ml，潤濕培養(yǎng)瓶,，然后再接種細(xì)胞原因是如果直接接種細(xì)胞的話,，肯定有的地方接觸了較多培養(yǎng)液，而有的地方幾乎就沒有培養(yǎng)液,，細(xì)胞當(dāng)然不會在沒有營養(yǎng)的地方待著了,。         

總之，先用少量培養(yǎng)液潤濕應(yīng)該是一個解決辦法,。 

我們的觀點為：   

1,、不洗的細(xì)胞傳代后，次日一般要換液一次,，除去沒有貼壁的死細(xì)胞．如果是懸浮生長的細(xì)胞則不用處理,。 

 2、用離心洗滌來出去殘留胰酶是不必要的,，增加污染機(jī)會,，也造成細(xì)胞丟失，還會使些一些細(xì)胞死亡,。 

   問題3：  以前一直養(yǎng)懸浮細(xì)胞,，現(xiàn)在養(yǎng)貼壁細(xì)胞，總感覺消化時間老是把握不好,，有時候消化過頭了,，損失很多細(xì)胞；有時又消化不充分,，導(dǎo)致吹打時候困難,，懇請各位給予指點！ 

   解答3：  消化時間和細(xì)胞類型,、消化液的消化能力,、細(xì)胞的密度等多種因素有關(guān)。一般養(yǎng)一種新的細(xì)胞要摸索一下消化時間,，掌握細(xì)胞消化到什么程度恰到好處,。新配的消化液消化能力較強(qiáng)，配好后可分裝成小管,，一次用完,，其余凍在－20℃,，以保持酶活力。消化液只需鋪滿瓶底即可,，可放入培養(yǎng)箱中,，因外在37℃時酶的活力高于常溫,，有利于縮短消化時間,。還有一種方法，就是將胰酶鋪滿瓶底后,，輕搖培養(yǎng)瓶,，使胰酶與細(xì)胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶,，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間,，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可,。細(xì)胞生長到覆蓋70～80％瓶底時消化較好,，若細(xì)胞密度過大則消化后細(xì)胞易成團(tuán)。

     消化時間不應(yīng)超過5分鐘,，否則對細(xì)胞損害很大,。消化液覆蓋細(xì)胞，成一薄膜,，然后反復(fù)傾斜,，使消化液沖刷細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞收縮,，部分細(xì)胞脫落時,，可用*培養(yǎng)基馬上中和，同時吹打壁上細(xì)胞,。應(yīng)該沒問題,。 消化的時間不能一概而倫，要看你的細(xì)胞的種類,，即使同一種細(xì)胞,，在不同的細(xì)胞株也回出現(xiàn)消化的時間不同的現(xiàn)象，象我們實驗室以前的VERO細(xì)胞就很好消化,，一般就是2-3分鐘左右,，現(xiàn)在重新拿了一株新的VERO細(xì)胞平均每次消化在5分鐘以上；其次要看你配的胰酶的質(zhì)量,，如果配的比較好,，消化的時候就要好消化一點，反之就久一點,。還要在你看到消化過頭的情況下,，如果細(xì)胞下來的比較多了,，這時你把CMF或PBS連同細(xì)胞棄去是很浪費(fèi)的，你還不如就連同CMF或PBS加上營養(yǎng)液一起傳,，因為營養(yǎng)液中有血清,，胰酶一遇到血清就會自動終止消化，當(dāng)然這樣對你的細(xì)胞是有一定的影響的,，但是這也是補(bǔ)救的*方法,，我消化過頭的時候都是這樣處理的，只要你的血清質(zhì)量夠好,，細(xì)胞一般都會張的較好,。 

   問題4：  本人用胰酶冷消化細(xì)胞后，終止消化后,，發(fā)現(xiàn)絮狀的組織細(xì)胞怎么也吹不散,，都不容易移入培養(yǎng)瓶。是為什么呢,？ 

   解答4：  我們實驗室使用胰酶消化細(xì)胞時胰酶并不預(yù)熱,，而是直接從4攝氏度冰箱中取出在室溫中直接使用，對消化效果影響不大,。不過我想可能有幾個原因：          

其一：細(xì)胞生長過度,，也就是在有限的空間里面細(xì)胞數(shù)量太多，相同時間內(nèi)消化進(jìn)行不徹

底,，導(dǎo)致大量細(xì)胞間連接沒有破壞掉,。          

其二：消化時間不夠。          

其三：樓上所說的情況我還沒有經(jīng)歷過,，可能也存在吧,。不過我想應(yīng)該取決于樓主用胰酶消化的細(xì)胞的性質(zhì)。          

在培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC-3M時也遇到過類似問題,。當(dāng)時是準(zhǔn)備做流式,，看藥物對細(xì)胞周期和調(diào)亡的影響。首先排除了藥物對細(xì)胞的影響,，后來發(fā)現(xiàn)可能是由于細(xì)胞屬高度轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系,，貼壁不牢，常規(guī)消化會破壞細(xì)胞膜,，出現(xiàn)非常難吹散的白色絮狀物,。于是嘗試了以下兩種方法：1、加入消化液使其撲滿瓶底后迅速將其倒出,，縮短消化時間,。2、不使用消化液，用培養(yǎng)液直接將貼壁細(xì)胞吹打下來,。此法會造成細(xì)胞丟失,，但*避免了消化液消化過度的影響，在細(xì)胞量較大時可嘗試,。此外,，還在文獻(xiàn)上看到常規(guī)消化后，加入含血清的PBS洗細(xì)胞,，終止殘存消化液的作用,，我沒有親自嘗試過。          

其實冷消化和熱消化都無所謂,，當(dāng)然一般熱消化會比冷消化要好一點,，因為胰酶在加熱時活性高一些,，這取決于你的細(xì)胞．出現(xiàn)絮狀物可能是你的細(xì)胞破碎后DNA釋放造成,，你可以試用ＤＮａｓｅ把它裂解掉．我也曾遇見過類似情況，加ＤＮａｓｅ就沒有了．當(dāng)然也可能是其它原因,，你可以摸索一下．ＤＮａｓｅ使用濃度一般２０－３０ｕ／ｍｌ,，你可以在配胰酶時直接加到胰酶中． 

   問題5：  我培養(yǎng)的是卵巢癌患者腹水中提取的原代腫瘤細(xì)胞，現(xiàn)在已經(jīng)鋪滿瓶底,。今晚消化傳代時,，發(fā)現(xiàn)用胰酶后消化15分鐘，也只有少部分細(xì)胞變圓飄起,，大部分細(xì)胞稍有皺縮,，但是貼壁還是很勞。吹打也掉不下來,。   我的胰酶是3－28配的,，配好后一直放在4度冰箱。是不是胰酶失效了,？還是原代細(xì)胞就是難消化,？

   回答5：  胰酶配好分裝后，置－20度備用,，使用之前37水浴溶解,，25cm2的培養(yǎng)瓶用2ml的胰酶，所以分裝時,，盡量考慮到每次的用量,，一次拿出來就用完。避免胰酶反復(fù)凍融超,，易失效,。       

 胰酶消化時，要在37度培養(yǎng)箱內(nèi)，一般0.25％胰酶2～3分鐘,，0.05％胰酶－EDTA 3～5分鐘,，貼壁細(xì)胞即可*飄起。          

像你這種情況,，估計是胰酶失效,，3月28到今天4月17日，你只是把胰酶放在4度保存,，時間和溫度都不合適,。   也有一種可能性：生長狀態(tài)不好的細(xì)胞，消化時間也會延長,。但我們還沒有消化超過5分鐘還不能work的情況,。