A549細(xì)胞的培養(yǎng)

A549細(xì)胞為人肺腺癌細(xì)胞,，屬于傳代細(xì)胞系,，可穩(wěn)定地傳代培養(yǎng)。一般用胰酶消化后,，加入生長(zhǎng)液稀釋,，以1：2～1：3傳代培養(yǎng)都是可行的。

一,、 [所需溶液]

細(xì)胞沖洗液：磷酸鹽緩沖液(PBS)——無(wú)Ca,、Mg

NACL                         8.00g；

KCL                          0.20g;

KH₂PO₄                                                 0.20g;

Na₂HPO_{4 .,。}12H₂O                 1.15g

加水至 1 000mL,將PH調(diào)至7.4,，高壓滅菌。

消化液

胰酶-PBS

結(jié)晶胰酶                      2.5g;

高壓滅菌后的PBS              1000ml

用磁力攪拌器攪拌均勻,，使其*溶解,，通過(guò)0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌,，分裝備用，放置—20℃保存,。

胰酶—EDTA:

結(jié)晶胰酶                      0.5g;

EDTA鹽溶液                    0.2g

無(wú)Ca,、Mg PBS                  1 000ml

用磁力攪拌器攪拌均勻,，使其*溶解,，通過(guò)0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌，分裝備用,，放置—20℃保存,。

細(xì)胞培養(yǎng)液：RPMI 1640培養(yǎng)液

配制方法：

1. 將一袋干粉型RPMI 1640培養(yǎng)基溶于900ml三蒸水中，沖洗包裝袋兩至三次倒入培養(yǎng)液中,。
2. 加入丙酮酸鈉 0.1g,，NaHCO₂ 2g以及雙抗，加入磁力攪棒并置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?。雙抗的配置濃度為 100U/ML 青霉素和100U/ML鏈霉素,。(一般市售的青霉素為80 萬(wàn) U/瓶，將其溶解于4ml三蒸水中,，每升培養(yǎng)液中加入0.5ml,；市售的鏈霉素為100 萬(wàn) U/瓶，將其溶解于5ml三蒸水中,，每升培養(yǎng)液中加入0.5ml),。
3. 調(diào)整培養(yǎng)液的ＰＨ值，用ＰＨ精密試紙觀察?。校龋?span>.２～７.４即可,。
4. 過(guò)濾法除菌，所使用的濾器為Ｏ_２加壓過(guò)濾,，０.２２μｍ濾膜,，濾膜事先采用高壓滅菌消毒。
5. 分裝,，加蓋瓶塞,，加封紗布報(bào)紙，用繩固定,，放置—20℃保存,。

二、［細(xì)胞的維持和培養(yǎng)］

• 細(xì)胞的復(fù)蘇

• 準(zhǔn)備一個(gè)盛有３７℃溫水的燒杯,，從液氮罐中取出存有Ａ５４９細(xì)胞的凍存管,，放于３７℃溫水中，用鑷子夾住輕輕搖動(dòng)使其迅速融化,。
• 1000～２000 r,，3～５min離心,。
• 在無(wú)菌操作臺(tái)中采用75%的乙醇*擦拭凍存管，然后打開(kāi)凍存管,，注意動(dòng)作要輕柔,。
• 用1ml槍頭將上清液去除，加入1ml預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞吹散開(kāi),，轉(zhuǎn)移至25cm²培養(yǎng)瓶中,。
• 補(bǔ)充4ml的RPMI 1640培養(yǎng)基，并且添加10%的胎牛血清,。
• 倒置顯微鏡下觀察,，37℃、5%CO₂培養(yǎng),。
• 24h后,，更換新的培養(yǎng)液。
• 常規(guī)傳代培養(yǎng),。

• A549細(xì)胞更換新的培養(yǎng)液

• 無(wú)菌操作打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶蓋,，倒掉培養(yǎng)液。
• 用PBS反復(fù)沖洗細(xì)胞2～3遍,。
• 加入新鮮的預(yù)熱好的培養(yǎng)液及10%的胎牛血清,。

各種液體需要量（ml）

• 倒置顯微鏡下觀察，37℃,、5%CO₂培養(yǎng),。

• A549細(xì)胞的傳代

• 無(wú)菌操作打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶蓋，倒掉培養(yǎng)液,。
• 向已經(jīng)長(zhǎng)滿的細(xì)胞中加入消化液1ml,，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有的細(xì)胞表面,，吸棄或倒掉,，輕輕沖洗細(xì)胞表面2～３遍，以盡可能去除原培養(yǎng)液中的牛血清,。
• 加入1ml消化液,，在37℃培養(yǎng)箱中孵育5～８min后把培養(yǎng)瓶放置在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的胞質(zhì)回縮,、胞間質(zhì)增大后,，立即終止消化。
• 加入5ml預(yù)熱至37℃的培養(yǎng)液,，用玻璃吸管反復(fù)吹打以分散細(xì)胞,。吹打過(guò)程按順序進(jìn)行，從培養(yǎng)瓶底部一邊開(kāi)始到另一邊結(jié)束,，以確保所有的底部都被吹到,。
• 吸取一半的細(xì)胞懸液,，接種到新的25cm²培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液,，并且添加10%～20%的胎牛血清,。通常每瓶液體量為5～10ml。
• 倒置顯微鏡下觀察,，37℃,、5%CO₂培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

• 所有液體在加入細(xì)胞瓶前均應(yīng)預(yù)熱到37℃,。所有液體均應(yīng)調(diào)整PH至7.2左右,，均不能超過(guò)7.4,。
• 細(xì)胞消化傳代時(shí)吹打不要產(chǎn)生氣泡,，吹打力量不宜過(guò)多，否則會(huì)損傷細(xì)胞,。
• 嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作的要求,。
• 盡可能減少消化液剩余量，過(guò)多時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷,，可多添加些含牛血清的培養(yǎng)液中和,。
• 培養(yǎng)瓶在室溫中放置時(shí)間應(yīng)盡可能短。

• A549細(xì)胞的凍存

• 消化已生長(zhǎng)融合的單層細(xì)胞,。
• 用生長(zhǎng)液懸浮細(xì)胞,，并且添加10%的FCS和10%DMSO(二甲基亞砜)。分裝在2ml容積的凍存管中,。
• 用本實(shí)驗(yàn)室自制的凍存包包裹好凍存管,，放在-70℃冰箱中一夜。
• 放入液氮中凍存,。