Invitrogen脂質(zhì)體2000說明書及注意事項

Invitrogen脂質(zhì)體2000的操作流程及注意事項

*,，Invitrogen脂質(zhì)體2000是廣大老師所熟知的轉(zhuǎn)染試劑,，其特點：轉(zhuǎn)染步驟快速簡便

（1）DNA-陽離子脂質(zhì)體試劑的復(fù)合體可以直接加入到細胞培養(yǎng)基中，有血清也不怕,。

（2）轉(zhuǎn)染后不需要除去Lipofectamine 2000試劑,，無需換培養(yǎng)基。

我們介紹一下 Invitrogen脂質(zhì)體2000的操作流程,、注意事項等,。

一、脂質(zhì)體2000操作流程   
事實上Lipofectamine系列產(chǎn)品操作流程都是又快又簡單：稀釋DNA以及Lipofectamine 2000,，混合2種稀釋液保溫20分鐘,，加入培養(yǎng)細胞中孵育24－96小時檢測結(jié)果。下面是Invitrogen提供的詳細流程和注意事項,。
1,、轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細胞并計數(shù),，細胞鋪板,，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%。細胞鋪板在0.5ml含血清,，不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中,。
2、對于每孔細胞,，使用50μl無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋0.8μg-1.0μg DNA,。3、對于每孔細胞,，使用50μl OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000試劑,。Lipofectamine 2000稀釋后保溫5分鐘（在30分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。保溫時間過長會降低活性,。） 注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀釋,，細胞也可以使用D-MEM培養(yǎng)。如果D-MEM做為Lipofectamine 2000的稀釋液,，脂質(zhì)體2000必須在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合,。
4,、混合稀釋的DNA（第2步）和稀釋的Lipofectamine 2000（第3步）。在室溫保溫20分鐘,。 注意：溶液可能會混濁,，但不會影響轉(zhuǎn)染。復(fù)合物可以在室溫保持6小時穩(wěn)定,。
5,、直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動培養(yǎng)板,，輕輕混勻,。注意：如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進行細胞鋪板,。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基，替換為0.5ml無血清培養(yǎng)基,。
6,、在37℃，5％的CO2中保溫24-48小時,，無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性,。
7、在細胞中加入復(fù)合物24-72小時后,，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色,，檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性,。對穩(wěn)定表達,，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素,。進行穩(wěn)定表達需要數(shù)天或數(shù)周,。
8、對于96孔板培養(yǎng),，不再需要提前一天進行細胞鋪板,，而可以直接在平板中制備復(fù)合物，然后將細胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了,，這樣進一步減少了轉(zhuǎn)染時間,。這種改進步驟已經(jīng)過293-H，293-F,，COS-7L和CHO細胞的試驗,，同傳統(tǒng)方法相比活性稍低?？旖莸牟襟E和蛋白表達細胞系的轉(zhuǎn)染使得Lipofectamine 2000非常適用于96孔板的高通量轉(zhuǎn)染,，比如cDNA文庫的篩選和蛋白瞬時表達,。

二、脂質(zhì)體2000適用細胞株范圍
不同的轉(zhuǎn)染試劑所適用的細胞株范圍各不相同,。一個實驗室常常會用到不止一種細胞株,，甚至是比較特殊的細胞株。一個轉(zhuǎn)染試劑所適用的細胞株越多,，當(dāng)然越受用戶的歡迎,。根據(jù)Invotrogen的資料，Lipofectamine 2000已經(jīng)證實可用于高達517種細胞株,，覆蓋了相當(dāng)廣的范圍,。要看看Lipofectamine 2000是否適用于你現(xiàn)有的細胞株，可以訪問以下Invitrogen（http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageID=9559&fuseaction=CellLines.dsp_searchRange）

三,、適用的核酸類型和DNA大小
有的轉(zhuǎn)染試劑是為siRNA轉(zhuǎn)染而設(shè)計的,，有的則是為DNA轉(zhuǎn)染設(shè)計。Lipofectamine 2000可以適用于包括DNA,，siRNA, dsRNA, 熒光標記的Oligo, RNA等在內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)染,，這使得Lipofectamine 2000適用范圍非常廣泛，無論是基因表達分析的DNA轉(zhuǎn)染,，或者是RNAi,，Lipofectamine 2000都能勝任，不需要為不同目的購買不同試劑了,。但,，zui常用的DNA轉(zhuǎn)染中有一個DNA大小的問題，太大的質(zhì)粒不那么好轉(zhuǎn),。

四,、用量
Lipofectamine 2000用的劑量根據(jù)說明書，24孔板轉(zhuǎn)染每次用2ul左右,，1.5ml Lipofectamine 2000大約可做750次24孔板轉(zhuǎn)染,，或者大約150次6孔板轉(zhuǎn)染。

五,、注意事項   
 Lipofectamine 2000要求細胞鋪板密度較高,，脂質(zhì)體2000以90%-95%為佳，這有助于減少陽離子脂質(zhì)體細胞毒性造成的影響,。Lipofectamine 2000可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染,，并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基，使得操作方便了許多,，但是要注意制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時要求用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑,，因為血清會影響復(fù)合物的形成。

復(fù)合物形成后是可以加入血清,。這里要特別注意檢測所用的無血清培養(yǎng)基是否能和Lipofectamine 2000匹配,，比如已知CD293, SFM II, VP-SFM就不行,。此外還應(yīng)該留意，如果研究的基因要求比較長的表達時間,，比如細胞周期相關(guān)基因,，或者時細胞表面蛋白，選擇細胞鋪板密較低的轉(zhuǎn)染試劑,，不適合用 Lipofectamine 2000,。

對于大多數(shù)陽離子脂質(zhì)體試劑，應(yīng)優(yōu)化DNA濃度和陽離子脂質(zhì)體試劑量以得到zui大的轉(zhuǎn)染效率,。DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例,，通常推薦是1:2或者1:3，優(yōu)化可以從0.5-5之間慢慢試,。使用小劑量確定的優(yōu)化條件可以用于進行大劑量的轉(zhuǎn)染,，只要根據(jù)培養(yǎng)板表面比例線性增加鋪板細胞的數(shù)目、陽離子脂質(zhì)體試劑和DNA量就可以了,。

還有轉(zhuǎn)染的時候培養(yǎng)基中不能添加抗生素,。抗生素,，比如青霉素和鏈霉素，一般對于真核細胞無毒,，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低,。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素,，甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素,。這樣，在轉(zhuǎn)染前就不必潤洗細胞,。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑,。另外,，為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量,。

陽離子脂質(zhì)體應(yīng)該在4度保存,，要注意避免多次反復(fù)長時間開蓋，因為可能會導(dǎo)致脂質(zhì)體氧化而影響轉(zhuǎn)染效率,。當(dāng)然還有要注意質(zhì)粒的質(zhì)量,，質(zhì)粒的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵,。

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