產(chǎn)品名稱：豬流行性腹瀉病毒抗體ELISA試劑盒

規(guī)格：96T

材料：

（1） 聚苯乙烯塑料微量組織培養(yǎng)板：4×10孔,，上海塑料三廠生產(chǎn)。

（2） 包被液（pH值96）：NaHCO3 293g,、Na2CO3 195g,，蒸餾水加至1 000ml，置4℃保存,。

（3） 洗滌液（001mol/L,、pH值74PBS）：NaCl 80g、KH2PO402g,、Na2HPO4•12 H2O 29g,、KCl 02g、Tween20 05ml,，加蒸餾水至1000ml,。

（4） 保溫液：牛血清白蛋白（BSA） 01g、005% PBSTween20 100ml,，4℃保存,。

（5） 底物溶液（OPDH2O2）

磷酸鹽檸檬酸緩沖液（pH值50）：02mol/L Na2HPO4（284g/L）257ml、01mol/L檸檬酸（192g/L）243ml,、蒸餾水50ml,。

底物溶液：磷酸鹽檸檬酸緩沖液100ml、鄰苯二胺（OPD）40mg,、30%H2O2 015ml,，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（6） 終止液（2mol/L H2SO4）：濃硫酸222ml,、蒸餾水1778ml,。

（7） 豬流行性腹瀉（PED）抗原：PEDV豬胎腸原代細胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融,，65℃ 30min滅活,。zui后以3 000 r/min離心30min,，取上清分裝，-20℃保存?zhèn)溆??？乖牡鞍诐舛葹?00μg/ml。

（8） 酶標兔抗豬抗體結(jié)合物：按郭春祥方法制備,。mol/L比為196,，酶結(jié)合物效價為1∶10 000。

（9） 被檢豬血清：采自疫區(qū)豬和病豬,。PEDV免疫豬血清及健豬血清分別用于陽性,、陰性對照。

（10） 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測儀：南京華東電子管廠生產(chǎn),。

操作步驟：

（1） 抗原包被：用包被液將PEDV抗原作1∶5稀釋包被反應(yīng)板，每孔100μl,，同時設(shè)陰性細胞培養(yǎng)物對照孔,，置4℃過夜。 

（2） 洗滌：用洗滌液洗滌2次,，每次2min,，瀝干。 

（3） 加入被檢血清：用保溫液將被檢血清作1∶100稀釋,，加入反應(yīng)板相鄰的兩個孔中,，每孔100μl。同時作陰,、陽性標準血清對照,，置37℃孵育1h。 

（4） 洗滌3次：方法同上,。 

（5） 加入酶結(jié)合物：用保溫液將酶結(jié)合物作1∶4 000稀釋,，加入反應(yīng)孔中，每孔100μl,，置37℃孵育1h,。 

（6） 洗滌3次：方法同上。 

（7） 加入底物：每孔100μl,，置室溫暗盒內(nèi)顯色20min,。 

（8） 加入終止液：每孔50μl，靜置5min,。 

（9） 測定OD值：用檢測儀,，于492nm波長，按儀器使用及制定標準要求調(diào)節(jié)儀器,，測定各反應(yīng)孔的OD值,，記錄結(jié)果,。 

結(jié)果判定凡檢測血清P/N值超過14的，均判為陽性,。肉眼觀察,，凡反應(yīng)孔的顏色比正常細胞對照孔、正常血清對照孔顏色深者為陽性,。 

注意事項 

1 在各載體中使用zui多的為聚苯乙烯塑料板,。不同廠牌，甚至不同批號的反應(yīng)板吸附性能往往有很大差異,，因此使用前需要加以選擇,。方法為：在整塊板上測定同一標本，求出每一對孔的平均OD值,，將此值與該板的總均值相比,，其差值需在±10%以內(nèi)。 

2 為了增加聚苯乙烯板對某些抗原或抗體的吸附作用,，可試用鞣酸處理,，牛血清白蛋白處理，改變載體的表面電荷,，引入化學(xué)基團等方法處理反應(yīng)板,。 

3 如非特異性吸附較強，需考慮采用封閉等方法排除,。（1） 封閉：可選用4%～10%牛血清白蛋白,、10%小牛血清、10%馬血清,、01%～25%明膠等,。 

（2） 去污劑：可阻止非特異吸附，而不影響特異性抗原抗體反應(yīng),。常用的有005%～05%吐溫20,、吐溫80、01%NP40等,。 

（3） 高鹽濃度緩沖液：如含05mol/L NaCl及005%吐溫的磷酸鹽緩沖液（pH值80）,。 

（4） 縮短孵育時間：保溫液中加入終濃度4%的聚乙二醇（PEG，MW6 000） 

可縮短抗原抗體反應(yīng)的孵育時間（20min以內(nèi)）,。 

4 由于反應(yīng)板可能存在邊緣效應(yīng),，因此測定標本時至少要取兩孔的平均值。 

5 各種常用的酶標反應(yīng)比色計性能不一,，測定時需根據(jù)各自的儀器確定閾值,。