便攜式三聚氰胺檢測儀

檢測方法
      便攜式三聚氰胺檢測儀,，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測定,。

檢測原理
      ,，酶聯(lián)免疫吸附測定法定量測定三聚氰胺殘留。利用萃取液通過均質(zhì)及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進行免疫測定,。先將三聚氰胺酶標記物,，樣品萃取物及標準加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應。在30分鐘的孵育過程中,，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標記物競爭結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體,，孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標記物。在用去離子水清洗結(jié)束后,，每孔中加入清澈的底物溶液,，結(jié)合的酶標記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍色的物質(zhì)。孵育30分鐘后停止此反應,，根據(jù)各孔顏色深淺進行數(shù)據(jù)讀取,。依據(jù)標準的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。

實驗所需設備及材料
三聚氰胺檢測試劑盒（目前常用進口試劑有美國Abraxis公司和美國Beacon公司的）
318C酶標儀一臺或MB100（配有450nm濾光片）
1－5ml可調(diào)移液器
100－1000ul可調(diào)移液器.
20－200ul可調(diào)移液器.
蒸餾水或去離子水..
可吸取50ul的移液器及吸頭.
可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸頭.
吸水紙或相當?shù)奈牧?
450nm的酶標儀.
計時器.
洗瓶
混旋器.
20mM PBS：0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.
注意事項
配套使用試劑，不要同其它公司的產(chǎn)品混用,，不要將不同批次的產(chǎn)品混用,。
樣品稀釋或含有雜質(zhì)很可能對結(jié)果的準確性有影響。
不要使用過期的產(chǎn)品,。
使用之前將所有試劑回升至室溫,，但不要放置超過24小時。
三聚氰胺屬于有毒性的化學品,，請小心處理,。
停止液是1N鹽酸，避免接觸皮膚,。
樣品制備（以美國Beacon試劑為例）
濕的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：100）
均質(zhì)樣品至布丁狀,。
稱取2g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并劇烈振蕩,。
超聲萃取1分鐘,。
漩渦混合1分鐘，然后靜置5分鐘,，使樣品分層,。
3000 g室溫離心5分鐘。
用玻璃纖維濾紙過濾上清液,，并將萃取液收集于一干凈試管中,。
用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
移取150 ul進行分析。
注意：用此方法測定了8個添加有15ppm三聚氰胺的貓糧（非要求召回）,，回收率范圍為75%-117%,。
本方法只可作為樣品篩選方法，不可作為終確認方法,。
小麥面筋蛋白萃取方法：（稀釋倍數(shù)：500）
1.均質(zhì)或混勻小麥面筋蛋白樣品,。
2.稱取0.2g均質(zhì)好的樣品加入10mL酸化的60%甲醇/水溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水)。
3.漩渦混合并超聲萃取,，使樣品溶解（確保樣品中沒有結(jié)塊）,。
4.用樣品稀釋液稀釋萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS）,。
5.10000轉(zhuǎn)/分離心上清液10分鐘,。
6.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中,。
7.移取150 ul進行分析,。
注意：如果樣品中含有大量的添加物，需要加入更大量的萃取溶液,，以保證萃取效率,。
操作人依據(jù)自己的判斷力,，如果測試結(jié)果比較高，需要加入兩倍的萃取溶液（0.2/20mL）,，進行二次測定,。
干的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：200）
1.質(zhì)器均質(zhì)干的寵物飼料樣品。
2.稱取1g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液,，并劇烈振蕩,。
3.超聲萃取1分鐘。漩渦混合1分鐘,，然后靜置5分鐘,，使樣品分層。
4.3000 g室溫離心5分鐘,。
5.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液,，并將萃取液收集于一干凈試管中。
6.用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
7.移取150 ul進行分析,。

免疫測定過程(注意:標準及樣品做平行試驗以增加準確度)
將所有試劑及樣品回升至室溫20-280C,，但不要放置超過24小時。
從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條,，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮
吸取150ul標準,、樣品到對應微孔中，必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取,，避免交叉污染。加入50ul三聚氰胺酶標記溶液到每個小孔中,。
混合60秒,，20-28攝氏度下孵育30分鐘。
將微孔中的溶液倒入水槽中,，用蒸餾水*充滿微孔,，震蕩后倒掉，重復三次,，總共四次洗板,。
在吸水紙上拍打，盡可能將水拍干,。
每個微孔中加入100ul底物溶液,。
20-28攝氏度下，孵育30分鐘,。
每個微孔中加入100ul停止液,。
450nm下讀板。
結(jié)果分析
MB100,，半定量的結(jié)果是由樣品的吸光率與標準的吸光率的簡單對比而來判定:樣品的顏色比標準的顏色淺則三聚氰胺的濃度比標準樣的濃度高,樣品的顏色比標準的顏色深則三聚氰胺的濃度比標準樣的濃度低,。
定量分析需要繪制以標準樣的吸光率為X軸,以標準樣的濃度的半對數(shù)為Y軸的曲線圖.依據(jù)標準樣吸光率的點畫成一直線,如此樣品的光吸收率可在線上找到,與此相對應的Y軸則為樣品的濃度,樣品光吸收率范圍應比標準樣的底范圍高,比高范圍低,即可說明此樣品中三聚氰胺的含量大于500ppb或小于20ppb,。

操作步驟：
 
試劑盒大同小異；
１．將樣品用甲醇或水提取,，離心
２．將試劑盒梅標板室溫下回溫至少一個小時
３．提取液＼標準１５０微升,，移入酶標板井
４．加入ＨＲＰ５０微升
５．震動，反應３０分鐘
６．倒掉反應液,，用清洗液沖洗４次,，吸水紙吸水
７．加入色原底物１００微升，放置３０分鐘
８．加入終止液１００微升,，
９．１５分鐘后４５０ｎｍ下比色
１０．根據(jù)標準曲線,，計算三聚氰胺的濃度
試劑盒，酶標儀４５０ｎｍ,，１０００微升＼２００微升,、５０微升移液槍和八道移液槍，吸水紙,，槍頭等,。
注意移液時間和避免交叉污染。每次要有標準曲線,。