犢牛睪丸細(xì)胞作為多種病毒增殖的基質(zhì)，已經(jīng)應(yīng)用在疫苗生產(chǎn)中,，并有廣泛的開發(fā)前景,，但是由于產(chǎn)犢季節(jié)的不均衡，給生產(chǎn)帶來了困難,，為了使生產(chǎn)不受季節(jié)影響,，同時為了避免由保存原代細(xì)胞量大、細(xì)胞復(fù)活率低的問題,，做了用液氮冷凍保存犢牛睪丸原質(zhì)細(xì)胞的試驗(yàn),。

1 材料與方法

1.1犢牛睪丸 出生三天內(nèi)的，未食初乳的本地黑白花公奶牛,。

1.2細(xì)胞冷凍液的配制

冷凍液Ⅰ號：按本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的方法配制,，配方略。

冷凍液Ⅱ號：按常規(guī)方法配制,，即含20%特牛血清,，含5%～10%二甲基亞礬的營養(yǎng)液。

1.3待凍存細(xì)胞的制備

1.3.1原質(zhì)細(xì)胞的制備：將犢牛睪丸細(xì)胞經(jīng)一定方法處理后,，即在原質(zhì)細(xì)胞自己接加入細(xì)胞凍存液中待凍,，一般一對牛犢睪丸制備的原質(zhì)細(xì)胞可分裝于3～5個安瓶中。

1.3.2原代細(xì)胞的制備：按常規(guī)方法消化犢牛睪丸,，制得細(xì)胞懸液,，放置37℃溫室培養(yǎng)，3～4天形成致密單層后,，按常規(guī)法消化,、洗滌、離心,，收集細(xì)胞泥,，分別加入適量的細(xì)胞冷凍液，待凍,。

1.3.3次代細(xì)胞的制備：將原代細(xì)胞按常規(guī)方法消化,、培養(yǎng)，得次代細(xì)胞單層,，再按上述方法收集細(xì)胞泥,，加入適量細(xì)胞冷凍液，待凍,。

2 細(xì)胞的冷凍

將上述加入細(xì)胞冷凍液Ⅰ號或Ⅱ號液的原質(zhì)細(xì)胞,、原代細(xì)胞、次原代細(xì)胞的細(xì)胞瓶,，放置4℃,、30分鐘,，再移到-50℃～-70℃冰箱中預(yù)冷2小時，然后迅速移到液氮罐中,。

3 細(xì)胞復(fù)蘇

將安瓶自液氮罐中取出,，立即放入38-40℃溫水中，使細(xì)胞在1分鐘內(nèi)融化,，無菌吸出細(xì)胞懸液,，加入新的生長液，將細(xì)胞稀釋成50萬個細(xì)胞/ml,，37℃培養(yǎng)4小時,，細(xì)胞貼壁后換液一次，繼續(xù)增減形成單層細(xì)胞,。

4 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

備注：

1 每批凍存細(xì)胞凍前都有正常細(xì)胞培養(yǎng)對照,，以確定細(xì)胞消化成功與否。

2 凍存細(xì)胞復(fù)活率是指復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)/凍前活細(xì)胞數(shù)比值,。

3 細(xì)胞生長情況批復(fù)蘇后37℃培養(yǎng)4天時細(xì)胞生長的致密情況,。

4 復(fù)蘇后的細(xì)胞接毒培養(yǎng)后，均能有效帶毒,，同正常培養(yǎng)細(xì)胞無差別,。

從上表可以看出：

1 用凍存方法保存牛睪丸原質(zhì)細(xì)胞，方法是可行的,，這給應(yīng)用牛睪丸細(xì)胞增值病毒的生產(chǎn)和試驗(yàn)帶來了極大的方便,，有利于適當(dāng)安排生產(chǎn)，同時給器官細(xì)胞的保存提供了可靠的依據(jù),。

2 從上表可見應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室配制的細(xì)胞凍存液凍存的細(xì)胞,，復(fù)蘇后的存活率要比正常的細(xì)胞凍存液要高。

3 從上表可以看出,，原代,、次代細(xì)胞經(jīng)凍存后，復(fù)蘇的存活率為零,，具體原因有待于今后進(jìn)一步探討,。