人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品：兔肝成纖維細(xì)胞中間普氏菌Prevotella intermedia大鼠原代DRG神經(jīng)元細(xì)胞AeromonasaquariorumAeromonasaquariorum兔肺巨噬細(xì)胞AcinetobacterradioresistensAcinetobacterradioresistens人腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞ArthrobacterilicisArthrobacteril

一,、細(xì)胞基本屬性：

 

包被條件： 

培養(yǎng)基：原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：  空氣,，95%,；CO2 ，5%

原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二,、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦,。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四,、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì)。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六、室溫1 000×g離心8min,，去上清液,。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻,，1 000×g，20min,，4℃離心,，去上清。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min,，去上清液,。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min，4℃),，1000×g,，4℃離心10min。

十,、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫),，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液,。

原代細(xì)胞使用方法：

是一種貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈呈鵝卵石樣,，不規(guī)則細(xì)胞,，在技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)操作流程下，細(xì)胞可傳2-3代,；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),。

客戶收到細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作,。

1. 取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶,，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜,，放入37℃,、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h,，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),。

2. 貼壁細(xì)胞消化

1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中,，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底后，吸出多余消化液,，37℃溫浴1-3min,；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后,，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化,；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代,，然后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基至5mL,，置于37℃、5%CO2,、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基,。

3. 細(xì)胞收貨脫落

1)收集所有細(xì)胞懸液,，1000rpm，離心5min,，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中,，重懸沉淀,，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化,；

3)經(jīng)1000rpm,，離心5min，丟棄上清,，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀,，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)；

4)待細(xì)胞貼壁后,，培養(yǎng)觀察,；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)。

5)原瓶內(nèi)貼壁細(xì)胞按正常消化處理,。

4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

因原代細(xì)胞貼壁特殊性,，貼壁的原代細(xì)胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實(shí)驗(yàn)器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板,、共聚焦培養(yǎng)皿等）時(shí),，需要對實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行包被，以增強(qiáng)細(xì)胞貼壁性,，避免細(xì)胞因沒貼好影響實(shí)驗(yàn),；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml）,，明膠（0.1%）,，依據(jù)細(xì)胞種類而定。懸浮/半懸浮細(xì)胞無需包被,。
公司正在出售的產(chǎn)品：
小鼠胚胎肌母細(xì)胞（2014年新引進(jìn)）（未分化,，可誘導(dǎo)分化形成肌纖維）（干細(xì)胞庫保藏）

人類胚胎干細(xì)胞H1（干細(xì)胞庫保藏）
人類胚胎干細(xì)胞BG01V（干細(xì)胞庫保藏）
人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)（干細(xì)胞庫保藏）
人類胚胎干細(xì)胞H9（干細(xì)胞庫保藏）
小鼠神經(jīng)干細(xì)胞NE-4C（干細(xì)胞庫保藏）
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)（干細(xì)胞庫保藏）
人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)（干細(xì)胞庫保藏）
EBV 轉(zhuǎn)化的絨猴白細(xì)胞，B95-8細(xì)胞
K562耐細(xì)胞株,，K562/ADR細(xì)胞
倉鼠卵巢細(xì)胞,，CHO-S細(xì)胞
倉鼠卵巢細(xì)胞，CHO細(xì)胞
倉鼠卵巢細(xì)胞,，LEC-1細(xì)胞
大鼠β胰島素瘤細(xì)胞,，RIN-m5f細(xì)胞
大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，DRG細(xì)胞
脆弱擬桿菌Bacteroides fragilis
脆弱擬桿菌VPI 2553 [EN-2; NCTC 9343]Bacteroides fragilis (Veillon and Zuber) Castellani and Chalmers
痤瘡丙酸桿菌Propionibacterium acnes
大斑凸臍蠕孢Exserohilum turcicum (Pass.) K.J. Leonard & Suggs
大腸埃希菌Escherichia coli
大腸埃希氏菌Escherichia coli
大腸埃希氏菌（大腸桿菌）Escherichia coli(Migula)CastellanietChalmers
大腸埃希氏菌（尿路致病性）Escherichia coli CFT073
大腸埃希氏菌K12Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers
大腸埃希氏菌K12定量菌株Quantitative strains of escherichia coli
人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞大腸埃希氏菌O157Escherichia coli O157:H7
大腸表達(dá)菌C43(DE3)C43(DE3)
大腸表達(dá)菌Rosetta(DE3) StrainRosetta(DE3) Strain
大腸表達(dá)菌Rosetta-gami(DE3)pLysSRosetta-gami(DE3)pLysS
大腸表達(dá)菌SHuffle T7 Express lysYSHuffle T7 Express lysY