小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品：小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞帶熒光CT26.WT+LUC（種屬鑒定）Geobacillus thermodenitrificans熱脫氮地芽孢桿菌鼻咽癌細(xì)胞株 6-b(STR鑒定正確)Flavobacterium hibernum冬天黃桿菌小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞Neuro-2a（種屬鑒定）Flavobacterium succinicans琥珀黃桿菌小鼠乳腺癌細(xì)胞帶熒光E0771+LU

一、細(xì)胞基本屬性：

包被條件： 

培養(yǎng)基：原代角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)體系

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二,、在超凈工作臺(tái)中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開(kāi)顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦,。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì)。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六、室溫1 000×g離心8min,，去上清液,。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻,，1 000×g，20min,，4℃離心，去上清,。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶,，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min,，去上清液,。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min，4℃),，1000×g,，4℃離心10min。

十,、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min,，室溫),，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過(guò)夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液。

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原代細(xì)胞使用方法：

是一種貼壁細(xì)胞,，細(xì)胞形態(tài)呈圓形,、卵圓形或多角形細(xì)胞，在技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)操作流程下,，細(xì)胞可傳2-3代,；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

客戶(hù)收到細(xì)胞后,，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作,。

1. 取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身,，拆下封口膜,，放入37℃、5%CO2,、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h,，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 貼壁細(xì)胞消化

1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中,，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底后，吸出多余消化液,，37℃溫浴1-3min,；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后,，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化,；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代,，然后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基至5mL,，置于37℃、5%CO2,、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察,；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基,。

3. 細(xì)胞收貨脫落

1)收集所有細(xì)胞懸液，1000rpm,，離心5min,，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中,，重懸沉淀,，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化,；

3)經(jīng)1000rpm,，離心5min，丟棄上清,，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀,，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；

4)待細(xì)胞貼壁后,，培養(yǎng)觀察,；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)。

5)原瓶?jī)?nèi)貼壁細(xì)胞按正常消化處理,。

4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

因原代細(xì)胞貼壁特殊性,，貼壁的原代細(xì)胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實(shí)驗(yàn)器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板,、共聚焦培養(yǎng)皿等）時(shí),，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行包被，以增強(qiáng)細(xì)胞貼壁性，避免細(xì)胞因沒(méi)貼好影響實(shí)驗(yàn),；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚賴(lài)氨酸PLL（0.1mg/ml）,，明膠（0.1%）,，依據(jù)細(xì)胞種類(lèi)而定。懸浮/半懸浮細(xì)胞無(wú)需包被,。