一,、細胞基本屬性：

O

包被條件： PLL(0.1mg/ml)，明膠(0.1%)

培養(yǎng)基：含F(xiàn)BS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：1:2

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

原代細胞實驗步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二,、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦,。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四、用細解剖鑷去除大腦白質,、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質。

五,、大腦皮質放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六、室溫1 000×g離心8min,，去上清液,。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻,，1 000×g，20min,，4℃離心,，去上清。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min，去上清液,。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min,，4℃)，1000×g,，4℃離心10min,。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min，室溫),，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液,。

原代細胞使用方法：

是一種貼壁細胞，細胞形態(tài)呈內皮細胞樣,，在技術部標準操作流程下,，細胞可傳2-3代；建議您收到細胞后盡快進行相關實驗,。

客戶收到細胞后,，請按照以下方法進行操作。

1. 取出T25細胞培養(yǎng)瓶,，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜,，放入37℃,、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h,，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

2. 貼壁細胞消化

1)吸出T25細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中,，輕微轉動培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個培養(yǎng)瓶底后,，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min,；倒置顯微鏡下觀察,，待細胞回縮變圓后，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化,；

3)用吸管輕輕吹打混勻,，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補充新鮮的培養(yǎng)基至5mL,，置于37℃,、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),；

4)待細胞貼壁后,，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基,。

3. 細胞收貨脫落

1)收集所有細胞懸液,，1000rpm，離心5min,，保留沉淀,；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀,，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min),；消化完向離心管內加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)經(jīng)1000rpm,，離心5min,，丟棄上清，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀,，接種于新的培養(yǎng)瓶內,；

4)待細胞貼壁后，培養(yǎng)觀察,；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預熱),。

5)原瓶內貼壁細胞按正常消化處理。

4. 細胞實驗

因原代細胞貼壁特殊性,，貼壁的原代細胞在消化后轉移至其他實驗器皿（如玻璃爬片,、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時,，需要對實驗器皿進行包被,，以增強細胞貼壁性,，避免細胞因沒貼好影響實驗；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ,，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml）,，明膠（0.1%），依據(jù)細胞種類而定,。懸浮/半懸浮細胞無需包被,。

公司正在出售的產(chǎn)品：

人II型肺泡上皮細胞Acinetobacter portensis

人氣管上皮細胞AGL1(pSoup)Chemically Competent Cell

人氣管平滑肌細胞AGL1農(nóng)桿菌

人支氣管上皮細胞AH109 酵母菌

人支氣管平滑肌細胞Alistipes indistinctus

人肺成纖維細胞Alistipes senegalensis

人肺動脈內皮細胞Anaerostipes hadrus

人肺動脈高壓血管內皮細胞Apibacter raozihei

人肺動脈平滑肌細胞Arthrographis kalrae

人肺癌細胞Aspergillus udagawae

人肺微血管周細胞B646L gene in pet-20b(+)大腸桿菌

人肺腺癌成纖維細胞B834(DE3) 大腸桿菌

人心肌細胞BJ5183 Chemically Competent Cell

人主動脈內皮細胞BJ5183-AD-1 Chemically Competent Cell

人心肌成纖維細胞BL21 Chemically Competent Cell

人心臟微血管內皮細胞BL21 CodonPlus (DE3)-RIPL大腸表達菌

人主動脈瓣膜間質細胞BL21 Star(DE3) 大腸桿菌

人冠狀動脈內皮細胞BL21(AI) 大腸桿菌

人冠狀動脈平滑肌細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-E-protein質粒）大腸桿菌

人頸動脈內皮細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-Helicase質粒）大腸桿菌

人頸動脈平滑肌細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP10質粒）大腸桿菌

人主動脈平滑肌細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP16質粒）大腸桿菌

人頸靜脈球瘤細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP1質粒）大腸桿菌

人動脈外膜成纖維細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP2質粒）大腸桿菌

人肝動脈內皮細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP6質粒）大腸桿菌

人肝動脈平滑肌細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP7質粒）大腸桿菌

人肺微血管內皮細胞人腔靜脈平滑肌細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP8質粒）大腸桿菌

人腔靜脈外膜成纖維細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-ORF10質粒）大腸桿菌

人主動脈外膜成纖維細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-ORF3A質粒）大腸桿菌

人食管上皮細胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-ORF6質粒）大腸桿菌