大鼠輸尿管平滑肌細胞的相關產(chǎn)品：小鼠肺成纖維細胞金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae(Metschnikoff)Sorokin小鼠肺大動脈內皮細胞塔賓曲霉Aspergillustubingensis(Schober)Mosseray小鼠肺大動脈平滑肌細胞海棗曲霉Aspergillusphoenicis(Corda)Thom小鼠肺大靜脈內皮細胞泡盛曲霉Aspergillusawam

一,、細胞基本屬性：

 

包被條件： 

培養(yǎng)基：含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

原代細胞實驗步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二,、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦,。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四、用細解剖鑷去除大腦白質,、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質。

五,、大腦皮質放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六,、室溫1 000×g離心8min，去上清液,。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻,，1 000×g,，20min,，4℃離心,，去上清。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min,，去上清液,。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min，4℃),，1000×g,，4℃離心10min。

十,、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min,，室溫),，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液。

原代細胞使用方法：

是一種貼壁細胞,，細胞形態(tài)呈長棱形,，在技術部標準操作流程下,，細胞可傳2-3代；建議您收到細胞后盡快進行相關實驗,。

客戶收到細胞后,，請按照以下方法進行操作。

1. 取出T25細胞培養(yǎng)瓶,，用75%酒精消毒瓶身,，拆下封口膜，放入37℃,、5%CO2,、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

2. 貼壁細胞消化

1)吸出T25細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中,，輕微轉動培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個培養(yǎng)瓶底后,，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min,；倒置顯微鏡下觀察,，待細胞回縮變圓后，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化,；

3)用吸管輕輕吹打混勻,，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補充新鮮的培養(yǎng)基至5mL,，置于37℃,、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),；

4)待細胞貼壁后,，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基,。

3. 細胞收貨脫落

1)收集所有細胞懸液,，1000rpm，離心5min,，保留沉淀,；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀,，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min),；消化完向離心管內加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)經(jīng)1000rpm,，離心5min,，丟棄上清,，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于新的培養(yǎng)瓶內,；

4)待細胞貼壁后,，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預熱),。

5)原瓶內貼壁細胞按正常消化處理,。

4. 細胞實驗

因原代細胞貼壁特殊性，貼壁的原代細胞在消化后轉移至其他實驗器皿（如玻璃爬片,、培養(yǎng)板,、共聚焦培養(yǎng)皿等）時，需要對實驗器皿進行包被,，以增強細胞貼壁性,，避免細胞因沒貼好影響實驗,；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ,，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）,，依據(jù)細胞種類而定,。懸浮/半懸浮細胞無需包被。
公司正在出售的產(chǎn)品：
大鼠肝癌細胞RH-35（種屬鑒定）

貓腦星形膠質細胞PG-4（S+L）
大鼠肺泡Ⅱ型細胞RLE-6TN（種屬鑒定）
人胰腺癌細胞JF-305 (STR鑒定正確)
大鼠結腸神經(jīng)元細胞
人畸胎癌細胞NCCIT(STR鑒定正確)
恒河猴腎細胞LLC-MK2（種屬鑒定）
人成巨核細胞白血病細胞MEG-01(STR鑒定正確)
小鼠腎集合管細胞(SV40轉化)M-1（種屬鑒定）
人黑素瘤細胞WM-266-4(STR鑒定正確)
小鼠膠質瘤細胞帶綠色熒光GL261/GFP（種屬鑒定）
人膀胱移行細胞癌UM-UC-3(STR鑒定正確)
人結直腸腺癌細胞LS174T(STR鑒定正確)
人胰腺癌細胞HS 766T(STR鑒定正確)
小鼠雜交瘤細胞 SDOW-17 （種屬鑒定）
墨西哥微小桿菌Exiguobacterium mexicanum
約氏不動桿菌Acinetobacter johnsonii
養(yǎng)料嗜冷桿菌Psychrobacter cibarius
阿德雷島節(jié)桿菌Arthrobacter ardleyensis
腐生葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus
反硝化卡斯特蘭尼氏菌Castellaniella denitrificans
同溫層芽孢桿菌Bacillus stratosphericus
解纖維芽孢桿菌Bacillus cellulosilyticus
美人魚發(fā)光桿菌Photobacterium damselae
食五環(huán)芳烴新鞘氨醇菌Novosphingobium pentaromativorans
大鼠輸尿管平滑肌細胞溝鞭藻赫夫勒氏菌Hoeflea alexandrii
運動替斯崔納菌Tistrella mobilis
海泥鼠尾菌Muricauda lutimaris
需鹽色鹽桿菌Chromohalobacter salexigens
站前喜鹽芽孢桿菌Halobacillus yeomjeoni