大鼠主動脈弓內(nèi)皮細胞的相關(guān)產(chǎn)品：小鼠下丘腦神經(jīng)元細胞擲抱酵母SporobolomycesroseusKluyveretvanNiel小鼠小腸黏膜上皮細胞栗酒裂殖酵母SchizosaccharomycespombeLindner小鼠小腸平滑肌細胞路德類酵母SaccharomycodesLudwigiiHansen小鼠小腸血管內(nèi)皮細胞小刺青霉PenicilliumspinulosumThom

一,、細胞基本屬性：

 

包被條件： 

培養(yǎng)基：原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)體系

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣 ，95%；  CO2 ,，  5%

原代細胞實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦,。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四,、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì),。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小,，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六,、室溫1 000×g離心8min,，去上清液,。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻,，1 000×g,，20min，4℃離心,，去上清,。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min,，去上清液,。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min,，4℃),，1000×g,，4℃離心10min。

十,、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min,，室溫),，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液。

原代細胞使用方法：

是一種貼壁生長細胞,，細胞形態(tài)呈上皮樣 ,，多角形細胞，在技術(shù)部標準操作流程下,，細胞可傳2-3代,；建議您收到細胞后盡快進行相關(guān)實驗。

客戶收到細胞后,，請按照以下方法進行操作,。

1. 取出T25細胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身,，拆下封口膜,，放入37℃,、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h,，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

2. 貼壁細胞消化

1)吸出T25細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次,；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中,，輕微轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個培養(yǎng)瓶底后，吸出多余消化液,，37℃溫浴1-3min,；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后,，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化,；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代,，然后補充新鮮的培養(yǎng)基至5mL,，置于37℃、5%CO2,、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),；

4)待細胞貼壁后，培養(yǎng)觀察,；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基,。

3. 細胞收貨脫落

1)收集所有細胞懸液，1000rpm,，離心5min,，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中,，重懸沉淀,，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化,；

3)經(jīng)1000rpm,，離心5min，丟棄上清,，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀,，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)；

4)待細胞貼壁后,，培養(yǎng)觀察,；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)。

5)原瓶內(nèi)貼壁細胞按正常消化處理,。

4. 細胞實驗

因原代細胞貼壁特殊性,，貼壁的原代細胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實驗器皿（如玻璃爬片,、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時,，需要對實驗器皿進行包被,，以增強細胞貼壁性，避免細胞因沒貼好影響實驗,；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ,，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）,，依據(jù)細胞種類而定。懸浮/半懸浮細胞無需包被,。
公司正在出售的產(chǎn)品：
人結(jié)直腸腺癌細胞COLO320 (STR鑒定正確)

人膽管癌細胞HuCCT1(STR鑒定正確)
小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM3（種屬鑒定）
人卵巢癌細胞Caov3(STR鑒定正確)
人膀胱移行細胞乳頭瘤細胞 RT4(STR鑒定正確)
人膠質(zhì)瘤細胞TJ905 (STR鑒定正確)
人主動脈血管平滑肌細胞HA-VSMC (STR鑒定正確)
人肝癌細胞HepG2 (STR鑒定正確)
大鼠輸尿管上皮細胞
人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細胞AN3CA(STR鑒定正確)
大鼠肺泡巨噬細胞NR8383（種屬鑒定）
人乳腺癌細胞Bcap-37(STR鑒定正確)
人皮膚成纖維細胞BJ(STR鑒定正確)
人胃癌細胞NUGC-3(STR鑒定正確)
大鼠腎小球系膜細胞
Brevundimonas vesicularis泡囊短波單胞菌
Rhodobacter veldkampii維氏紅細菌
Rhodospirillum rubrum深紅紅螺菌
Geobacillus stearothermophilus嗜熱嗜脂肪地芽孢桿菌
Mycobacterium abscessus膿腫分枝桿菌
Klebsiella oxytoca產(chǎn)酸克雷伯氏菌
Arthrobacter nicotianae煙草節(jié)桿菌
Brevundimonas subribrioides納斯達短波單胞菌
Lactobacillus amylophilus嗜淀粉乳桿菌
Lactobacillus amylovorus食淀粉乳桿菌
大鼠主動脈弓內(nèi)皮細胞Lactobacillus parakefiri類高加索酸奶乳桿菌
Halobacillus halophilus嗜鹽喜鹽芽孢桿菌
Halobacillus trueperi楚氏喜鹽芽孢桿菌
Xanthomonas campestris野油菜黃單胞菌
Alicyclobacillus sp.脂環(huán)酸芽孢桿菌