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降低ELISA試劑盒背景因素
閱讀：289 發(fā)布時(shí)間：2016-4-5ELISA試劑盒對(duì)于科研人員來說ELISA原理和操作步驟并不陌生，不外乎固定抗原,，添加一抗,、二抗和底物，操作過程中夾雜著洗滌和封閉步驟,。然而,，即使是平淡無奇的洗滌和封閉，如果操作不合理,，也會(huì)很大程度上影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度,。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)我們是否能獲得有意義而且準(zhǔn)確的信息，這在很大程度上取決于結(jié)果的信噪比,，背景噪音會(huì)在很大程度上影響科研人員對(duì)結(jié)果的判斷,。
關(guān)于如何在實(shí)驗(yàn)過程中降低ELISA背景因素的影響，下面介紹一些步驟要點(diǎn)。
洗滌很重要
洗滌步驟看似很簡單無聊,，其實(shí)很重要,，因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測(cè)試劑)殘留在微孔板中，就會(huì)增加背景噪音,。如有必要,，可增加洗滌液中的鹽濃度，這會(huì)阻止非特異結(jié)合反應(yīng),。如果背景過高,，ELISA試劑盒懷疑洗滌不夠，可以嘗試增加洗滌次數(shù),。
封閉更關(guān)鍵
封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn),。這就降低了可產(chǎn)生信號(hào)的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會(huì)。實(shí)驗(yàn)過程中達(dá)到抗體只與目的蛋白結(jié)合的目標(biāo),。如果背景過高,，懷疑封閉不充分，可以嘗試使用更高濃度的封閉液,，或適當(dāng)延長封閉時(shí)間,。
如果您一直被背景問題所困擾，那就應(yīng)該花些時(shí)間來優(yōu)化封閉液,。這可能需要時(shí)間,，但也是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑,。使用的類型須取決于多個(gè)因素,，包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原,、您的抗體和檢測(cè)試劑,。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合，但它不應(yīng)當(dāng)與抗原,、抗體或檢測(cè)試劑發(fā)生相互作用,。
zui常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜,、穩(wěn)定,，在去除洗滌過程中的一些非特異結(jié)合上很有用。但它們只在存在時(shí)起作用,，因?yàn)楹苋菀妆幌吹?。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液。請(qǐng)勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%),，它會(huì)降低特異結(jié)合,，產(chǎn)生假陰性,。另一個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液，后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉,。
蛋白封閉液則有所不同,，是*的。它們與開放位點(diǎn)結(jié)合并封閉,，同時(shí)穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子,。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉,、正常血清和魚明膠,。血清組分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用。不過,，它的缺點(diǎn)在于能與Protein A和IgG抗體相互作用,。解決這個(gè)問題的一種方法是使用雞或魚的正常血清。
抗體濃度須優(yōu)化
通常我們會(huì)仿照“實(shí)驗(yàn)前輩”留下來的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn),，但是如果試劑稍有不同，則可能需要優(yōu)化抗體的量,。記住,，非特異的抗體結(jié)合會(huì)增加背景。為了防止這一點(diǎn),，切勿使用過多的一抗或二抗,。
檢測(cè)試劑要適量
另一點(diǎn)也很顯而易見：切勿使用過多的檢測(cè)試劑。如果濃度過高,，或者未正確稀釋,，則會(huì)導(dǎo)致高背景。也不要顯色過度,，如有必要,，優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液。
如果ELISA遇到了高背景,，那么也無需太擔(dān)心,，依次查看ELISA系統(tǒng)中的組分，并排除可能存在的問題,。悉心優(yōu)化,，相信很快就會(huì)有有意義而且準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
DR5 死亡受體5抗體
Desmoglein 4 橋粒芯糖蛋白4抗體
DAP12 自然殺傷激活受體相關(guān)蛋白DAP12抗體
DAP12 自然殺傷激活受體相關(guān)蛋白DAP12抗體
DAZ4 無精癥缺失基因4抗體
Dppa4 多能發(fā)育相關(guān)基因4抗體
DZIP1 鋅指蛋白DZIP1抗體
DLL1 Notch信號(hào)通路Delta樣配體1抗體
Dlx1 同源轉(zhuǎn)錄因子DLX1抗體
CDC37 Hsp90輔助伴侶分子CDC37抗體
Dystrophin 肌營養(yǎng)不良蛋白抗體
Dematin 金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1抗體
DKK1 抑癌蛋白DKK1抗體
Dispatched 膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DISPA抗體