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ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體
閱讀：390 發(fā)布時間：2015-11-26從人胃粘膜成功地分離出幽門螺桿菌（Hp）之后,，Hp與胃炎、消化性潰瘍的相關(guān)性引起人們極大的興趣,。人們推測其可能成為這類疾病的致病因素之一,。許多研究者正進一步探索其致病機理，并從不同角度尋找快速,、可靠的檢測方法,。迄今為止，檢測Hp的方法包括組織標本培養(yǎng),，切片染色,，細菌直接涂片染色,，快速尿素酶測定及13C尿素呼吸試驗和14C尿素呼吸試驗等。除尿素呼吸試驗外其余方法均需通過胃鏡檢查才能完成,，鑒于取材困難,，進一步尋找檢測Hp感染的免疫學方不進非常必要的。國外有人用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測臨床病人血清中有Hp抗體報道,，國內(nèi)尚未有這方面研究報告。本文報道建立一種檢測人體抗Hp抗體的ELISA的實驗結(jié)果及與細菌培養(yǎng)法和尿素酶測定法對比檢測結(jié)果,，研究證明本法特異,、敏感、適用于大量標本普查和及時判斷治療反應(yīng),，現(xiàn)將結(jié)果報告如下,。
1 材料和方法
1.1 材料
①40孔聚苯乙烯微量凹孔板：上海塑料三廠產(chǎn)品。②酶聯(lián)板離心籃：根據(jù)40孔酶聯(lián)板本實驗室自行設(shè)計制成,。③DG—Ⅰ型酶聯(lián)免疫檢測儀：南京華東電子管廠產(chǎn)品,。④試劑：過氧化物酶（HRP），R2＝3.2,，美國Sigma公司產(chǎn)品,。鄰苯二胺（OPD）：上海白鶴化工廠產(chǎn)品，按文獻配制,。包被液：取碳酸鈉1.59g加碳酸氫鈉2.93g,，蒸餾水1000ml配成。洗滌液：以上未加吐溫—20的洗滌液100ml＋2％小牛血清＋4％聚乙二醇（PEG）,。封板液：5％小牛血清,。戊二醛固定液：25％戊二醛液，100ml裝,，Kochligh進口分裝,，用時稀釋成0.25％戊二醛固定液。終止液：2NH2SO4,。⑤抗原的制備：將澳大利亞*佩思醫(yī)院的Hp標準菌株（NCTC11638）及從胃鏡檢查患者胃粘膜活檢標本分離出的Hp菌株分別接種于心腦血平板,，37℃培養(yǎng)5d后取菌落作生化與血清學鑒定（自制兔抗Hp抗體），然后取單個菌落移種于另一血平板,，繼續(xù)培養(yǎng)3d,，經(jīng)鑒定后將其大量增殖培養(yǎng)，3d后將菌苔刮下,，置生理鹽水中制成菌液,，加福爾馬林固定（0.1％～0.3％），3000r/nin離心30min,，沉淀3次,，將zui后1次沉淀懸于少量PBS液內(nèi),，用比濁管沒出細菌濃度，制成含菌3×109ml,，置冰箱冰凍,，反復(fù)凍融3次，經(jīng)顯微鏡檢查無菌體存在后,，制成可溶性抗原,，采用Lowry氏法蛋白定量，－20℃保存?zhèn)溆?。⑥臨床血清標本：采自胃鏡檢查患者,，隨機采取1988年8～10月胃鏡檢查病人共38人，抽靜脈血2ml,，分離血清貯存－20℃?zhèn)溆?。⑦陰性對照血清，進行ELISA測定,，取其平均OD值作對照,。⑧酶標羊抗人IgG結(jié)合物（SAHIgG—HRP）的制備：按過碘酸鹽改良法，略加改進標記制成酶標抗體,。即HRP8.0ml,，22℃較攪20min。加乙二醇6滴,，繼續(xù)攪拌5min,，對pH4.2，0.001mol/L醋酸鹽緩沖液（用2molHC1調(diào)pH）透析,，中間換水4次,，加羊抗人IgG（上海生物制品研究所產(chǎn)品）14mg，逐滴加pH,，1.0mol碳酸鹽緩沖液,，使pH升到9.0～9.5，室溫較攪2h,，加硼氫化鈉（4mg/ml）0.2ml,，置4℃2h，對pH7.2,，0.01molPB－0.4molNaCl緩沖液在4℃透析平衡,。換水4次，收取透析袋內(nèi)結(jié)合物,，以50％飽和度硫酸銨溶液鹽析去除游離酶后,，測定精制結(jié)合物，E/P克分子比值合格后,，將結(jié)合物小瓶分裝置－20℃保存,，備用,。⑨尿素酶測定法和Hp的分離培養(yǎng)法參考文獻進行。
1.2 方法
并稍加改進,，即：抗原包被微量滴定板：用包被液將抗原按2×108億/ml（含蛋白8.6μg）稀釋后,，每孔加100μ，離心籃離心20min2000r/min后,，倒去孔內(nèi)液體,，然后加入0.25％戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min,，倒去戊二醛,，用洗滌液洗3次（每次3min），加5％小牛血清液,，200ml/孔，經(jīng)37℃30min封板后倒去孔內(nèi)液體,。每孔加待檢血清(1：100稀釋)100ml,，37℃保溫1h后，如上洗滌3次,，同時做陰性對照孔和空白孔,。之后于各孔內(nèi)加和新鮮稀釋的酶標羊抗人IgG結(jié)合物100ml，37℃保溫半小時,，于各孔中加入2NH2SO450μl終止反應(yīng)后,，于酶聯(lián)測定儀以波長490nm測定OD值，將測得標本OD值（P）與陰性對照OD值（N）比（P/N）,，若P/N比大于或等于2.0為陽性,。
2 結(jié)果
2.1 ELISA的建立
為了知道所制備的SAHIgG－HRP在是接ELISA中的活性（結(jié)合*抗體，效價）,，將此酶標抗體稀釋成1：16000,，1：32000，1：64000,，1：128000,，1：256000，1：512000六種濃度,，將作*抗體的已知病人Hp感染陽性血清稀釋成1：100包被微板的Hp抗原濃度為2×108mg/ml,，按上述步驟和主法進行ELISA試驗。結(jié)果表明,，所標記的羊抗人IgG酶標抗體當稀釋度為1：32000～1：512000時,，它們的P/N值均為≥2.0，因此,，了保證實驗結(jié)果穩(wěn)定采用個單位效價,，即用1：256,000稀釋度作正式實驗elisa試劑盒
為了解Hp抗原在包被微量滴定板中zui適濃度,，將Hp抗原用抗原包被液分別按蛋白濃度稀釋成0.27，0.54,，1.08,，2.15，4.3,，8.6,，17.2及34.4μg/ml8種濃度，然后分別進行包被,，與*抗體陽性血清(1：100)和SAHIgG—HRP(1：256000)按上述步驟和方法進行ELISA試驗,。結(jié)果，當Hp抗原濃度為8.6～17.2％μg/ml時OD值zui高,，Hp抗原在34.4μg/ml時,，OD值下降，因此Hp抗原包被量zui適濃度為.8.6～17.2μg/ml,。以后實驗用此抗原濃度包板,。
為了確定用ELISA測定病人抗Hp抗體的陽性血清濃度，用Hp抗原8.6μg包板,，SAHIgG—HRP仍用二個單位（1：256000）,，將二份陽性血清混后后稀釋成1：50，1：100,，1：200,，1：400和1：800五種濃度進行ELISA試驗，測定OD值的結(jié)果,。結(jié)果顯示陽性血清稀釋度與OD值呈較好的線性關(guān)系,，當血清稀釋度為1：50時OD值為1.521，1：100時OD值是1.172,，P/N比值均大于2.0,，故以后實驗中*抗體的血清濃度均用1：100的稀釋度。
為了驗證ELISA間接法用于檢測Hp抗體的特異性,，進行特異性吸收試驗,。選用8份Hp感染性血清以1：50稀釋，加等量Hp菌懸液,，混勻置37℃半小時,，再置吸收后離心取上清液按上述實驗條件和方法進行ELISA測定，結(jié)果見表1,。
表1 特異吸收抑制試驗結(jié)果
吸收處理 8份陽性血清的OD值 1 2 3 4 5 6 7 8 未吸收 1.588 1.230 1.220 1.555 1.420 1.384 1.354 1.266 吸收后 1.366 0.980 0.917 1.048 1.039 1.039 0.999 0.677 抑制結(jié)果 ＋ ＋ ＋ elisa試劑盒
從表1結(jié)果可知,，陽生血清經(jīng)吸收1次后，OD值均較吸收前下降，特別8號血清前后相比下降了50％,，由此均顯示特異吸收抑制試驗陽性,，證明該8份陽性血清的抗Hp抗體是特異的。為了探索所建立的ELISA間接法檢測抗Hp抗體的敏感度,，選擇6份抗p陽性血清按上述實驗條及方法進行ELISA檢測,，同時與試管凝集試驗和顯微凝集試驗進行比較，結(jié)果見表2,。
表2 ELISA測定Hp抗體敏感比較結(jié)果
吸收處理 6份抗Hp陽性血清測出的zui終抗體滴度 1 2 3 4 5 6 7 ELISA ＞800 ＞800 ＞800 ＞800 ＞800 ＞800 ＞800 試管凝集 160 320 320 640 320 320 320 顯微凝集 320 320 320 320 320 320 320
數(shù)字為稀釋倍數(shù)的倒數(shù)elisa試劑盒
從表2結(jié)果表明,，6份抗Hp抗體陽性血清用所建立的ELISA間接法測出的抗體效價均＞1：800，試管凝集試驗測出的抗Hp抗體效價為1：160～1：640,，顯微凝集試驗測出的抗Hp抗體效價為1：160～1：320,，顯然ELISA法比后兩者方法敏感的多。
批內(nèi)誤差 將4份陽性血清標本在同一塊板上按上述方法重復(fù)進行9次ELISA試驗,，計算各份標本檢測OD值結(jié)果的變異系數(shù)（表3）,。
表3 4份陽性血清重復(fù)9次ELISA檢測(x)
陽性血清號 1 2 3 4 x 0.510 0.394 0.416 0.207 SD 0.028 0.032 0.030 0.014 SV（％） 5.6 8.1 7.19 6.57
從表3得知，批內(nèi)誤差范圍是5.5％～8.1％,，平均6.87％,，顯示按上述實驗條件建立的檢測Hp抗體的間接法ELISA的穩(wěn)定性好，重復(fù)性佳,。
批間誤差 將5份陽生血清，按上述方法及實條件在1W內(nèi)反復(fù)進行3次ELISA,，計算各份標本檢測OD值結(jié)果的變異系數(shù)（表4）,。結(jié)果指出三批陽性標本的變異系數(shù)在0.74％～8.12％之間，平均4.67％,，由此亦顯示按上述實條件建立的檢測Hp抗體的間接法ELISA重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好,。
2.2 臨床標本檢測結(jié)果
將胃鏡檢查患者的血清以1：100稀釋，用上述實驗條件建立的ELISA間接法進行,，Hp抗體（ELISA－HpAb）檢測,，同時將同一患者胃粘膜進行Hp分離培養(yǎng)（HpC）和Hp尿素酶測定（HpUT），以資比較（表5）,。
表4 5份陽性血清標本進行ELISA的批間誤差試驗結(jié)果
標本號 分批檢測陽性血清的OD值 X SD SV（％） 1 2 3 1 1.266 1.121 1.207 1.198 0.073 6.09 2 1.108 1.021 1.101 1.112 0.049 4.36 3 1.209 1.028 1.125 1.121 0.091 8.12 4 1.060 1.142 1.135 1.112 0.045 4.04 5 1.112 1.096 1.107 1.105 0.008 0.74
表5 ELISA法培養(yǎng)法和尿素酶法對比
方法 n 檢測結(jié)果 陽性數(shù) 陰性數(shù) 陽性率（％） ELISA－HpAb 38 34 4 89.4 Hp培養(yǎng)法 38 23 15 60.5 HpUT法 38 22 16 57.9
表5結(jié)果指出,，ELISA－HpAb法的陽性數(shù)為34/38（89.4％），Hp培養(yǎng)法的陽性數(shù)23/38（60.5％）,，HpUT法的陽性數(shù)為22/38（57.9％）,，表明ELISA－HpAb法敏感性較另二法都高（ELISA與CP培養(yǎng)法比較X2＝8.94，P＜0.01,。ELISA－HpAb與HpUT比較X2＝9.77,，P＜0.01。）38例患者用ELISA－HpAb法與培養(yǎng)法（HpC）和HpUT法結(jié)果符合率比較，結(jié)果見表6及表7,。
表6 ELISA－HpAb法與HpC法符合率比較
ELISA－HpAb Hp培養(yǎng)法 合計 ＋ － ＋ 22 12 34 － 1 3 4 合計 23 15 38
表7 ELISA－HpAb法與HpUT法符合率比較
ELISA－HpAb HpUT 合計 ＋ － ＋ 22 12 34 － 0 4 4 合計 22 16 38
表6及表7比較結(jié)果表明,，ELISA－HpAb與HpC法的總符合率為65.80，與HCPUT法總符合率為68.4％,。在ELISA－HpAb法的34例陽性中HpC法和HpUT法的23例及22例陽性中,，ELISA－HpAb法只有一例未檢出，由此均表明,，ELISA－HpAb法比HpUT法敏感,。
3 討論
關(guān)于診斷Hp病的血清學方法，至目前為止主要有補體結(jié)合試驗,，被動血凝集試驗,，細菌凝集試驗等法。但由于這些方法操作繁鎖,，或敏感性低,，或可靠性欠佳，故現(xiàn)已較少采用,。自ELISA法建立以來,，證明具有敏感性高，穩(wěn)定性強等優(yōu)點,，國外報道已有人用此法來檢測人血清中抗Hp抗體,，也證實特異、敏感,。但國內(nèi)尚未有報道證實此法能否用于Hp抗體的檢測和診斷Hp感染,。本文報道所建立的檢測Hp抗體的間接ELISA法實驗和初步用于臨床標本檢測結(jié)果證實具有較好的特異性，敏感性（比試管凝集和顯微凝集試驗敏感＜2～3倍）和重復(fù)性,。為快速診斷Hp提供較好的方法（表1～7）,。然而其中操作步驟除按文獻報道的一般流程（Hp抗原包被微板→甲醛固定→封閉（牛血清白蛋白）→人Hp抗體溫育→羊抗人IgG酶標抗體溫育→底物顯色→酶聯(lián)測定儀測定）外，作了若干改進：①Hp抗原的制備：根據(jù)文獻報告,，抗原的制備有超聲粉碎,，福爾馬林固定處理等方法。但Goodwin等認為經(jīng)過鹽酸—甘氨酸制成的可溶性抗原應(yīng)用于ELISA更加可靠,。本文采用抗原是經(jīng)過福爾馬林殺死和固定,，用PBS洗三次，置冰箱反復(fù)凍融3次后制成的Hp抗原,，用蛋白濃度為8.6μg/ml包被微板亦可獲得滿意結(jié)果,。②通過2000r/min，20min離心沉淀,，戊二醛合固定30min的抗原代替包被同樣得到滿意結(jié)果,。③檢測血清標本陽性的稀釋度（陽性滴度或陽性單位）：Goodwin等的報告，用ELISA檢測病人血清抗Hp抗體的滴度認為在＞1：300（或＞300EU）與Hp的胃疾患非常接近。本文通過選擇10歲以下兒童血清作正常對照和已知Hp陽性血清進行ELISA試驗,，根據(jù)P/N≥2的判定陽性標準原則結(jié)果表明以1：100以上（或＞100EU）作為陽性血清標本6份滴度較高的與試管凝集和顯微凝集試驗對比測定,，結(jié)果表明，在后二者方法中,，均有1：320的抗Hp抗體（表2）,。由此也證明用兒童血清作正常對照用用此判斷陽性標準是可靠的；同時證實這些病人血清中確實有較高抗Hp抗體,。但是,，此等判定陽性標準是否非常合適還待進一步實踐證實。
ELISA－HpAb法與HpC法和HpUT法的結(jié)果比較,，前者比后二者的陽性數(shù)高（89.4％）,，符合率分別是65.8％和68.4％（表5）。但常規(guī)培養(yǎng)法需時3d～7d,，HpUT法較快速,，但受活檢粘膜內(nèi)菌量多少及取材部位影響較大，短暫停留在胃內(nèi)的腸道菌易造成假陽性結(jié)果,。因此特異性不如ELISA－HpAb法,。但是，ELISA－HpAb法與HpC和HpUT法檢出的陽性病例數(shù)與胃鏡檢查的診斷和病理診斷是否*相符,，有待進一步的研究和分析,。