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七月十號ELISA試劑盒的試驗原理

    P-selectin試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知P-selectin濃度的標準品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測,。先將P-selectin和生物素標記的抗體同時溫育,。洗滌后,，加入親和素標記過的HRP,。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A,、B,，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色,。顏色的深淺和樣品中P-selectin的濃度呈比例關(guān)系,。

    1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔，在*,、第二孔中分別加標準品100μl,，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl,，混勻,；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,，再在第三,、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別加到第五、第六孔中,，再在第五,、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻,；混勻后從第五,、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,，再在第七,、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七,、第八孔中分別取50μl加到第九,、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，濃度分別為1800ng/L,，1200ng/L ，600ng/L,，300ng/L,， 150ng/L）。

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）,、待測樣品孔,。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。

4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl,，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3,。

8. 洗滌：操作同5,。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。

11.測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。