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氨基酸的分離與鑒定
閱讀：432 發(fā)布時間：2016-6-13 ELISA試劑盒紙層析是以濾紙作支持物,，用一定的溶劑系統(tǒng)展開，使混合樣品達(dá)到分析的層析方法,。其一般操作是將樣品溶解在適當(dāng)溶劑中,，點(diǎn)樣在濾紙的一端，再選用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng),，從點(diǎn)樣的一端通過毛細(xì)現(xiàn)象向另一端展開,，展開完畢，取出濾紙晾干或烘干,，再以適當(dāng)?shù)娘@色劑或紫外燈,、熒光燈下觀察其圖譜,。樣品經(jīng)展開后某一物質(zhì)在紙層析譜上的位置常用比移植Rf來表示,。
Rf=原點(diǎn)至紙層析斑點(diǎn)中心點(diǎn)的距離→原點(diǎn)至溶劑前沿的距離
紙層析可看作是溶質(zhì)（樣品）在固定相與流動相之間的連續(xù)抽提，由于溶質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離,。一定的物質(zhì)在兩相間有固定的分配系數(shù),，因而在恒定條件（液劑、pH,、溫度）下,，各物質(zhì)有固定的Rf值，據(jù)此可達(dá)到分析鑒定的目的,。
由于濾紙纖維可吸收20%～25%的水分,，且其中6%～7%以氫鍵形式與纖維素上羥基結(jié)合，一般條件下難脫去,。所以紙層析實(shí)際上是以水相作固定相,，展開的溶劑作流動相。
紙層析操作按溶劑展開方向可分為上行,、下行和徑向三種,。氨基酸分離一般用上行法。上行法又分單向（成分較為簡單的樣品）和雙向（單向時斑點(diǎn)重疊分離不開,，于是在其垂直方向用另一種溶劑系統(tǒng)展層）,。雙相層析譜可分辨十幾種以上的樣品。
（1）,、被分離物質(zhì)在該溶劑系統(tǒng)中Rf在0.05～0.8之間,，且各組分之Rf值相差能大于0.05，以免斑點(diǎn)重疊,。
（2）,、溶劑系統(tǒng)中任一組分與被分離物之間不能起化學(xué)反應(yīng),。
（3）、被分離物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的分配較恒定,，不隨溫度而變化,，且易迅速達(dá)到平衡，這樣所得斑點(diǎn)較圓整,。
本實(shí)驗(yàn)采用八中混合氨基酸為樣品,，用酸性和堿性兩種溶劑進(jìn)行雙向?qū)游觯攒崛獮轱@色劑,，可獲得分離清晰的層析圖譜,。
試劑和器材
1）、試劑
0.1%（w/v）茚三酮丙酮液,。
溶劑系統(tǒng)：*相：正丁醇：88%甲酸：水=15:3:2（V/V）,。
第二相：正丁醇：呲啶：98%乙醇：水=5:1:1:1（V/V）。
2）,、測試樣品
標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合溶液：亮氨酸,、纈氨酸、苯丙氨酸,、脯氨酸,、丙氨酸、天門冬氨酸,、組氨酸,、絲氨酸各100mg溶于50mL0.01ml/L鹽酸中。
3）,、器材
層析缸25cm×40cm（×2）,；培養(yǎng)皿15cm（×2）；噴霧器,；毛細(xì)管內(nèi)徑0.1cm,；電吹風(fēng)；烘箱,；層析濾紙12cm×12cm,；鉛筆，尺,。
操作方法
1）,、點(diǎn)樣
取層析濾紙一張（12cm×12cm），在距紙邊1.2cm處劃一基線,，再將紙轉(zhuǎn)90度,，距紙邊1.2cm處作一線與上線垂直。以毛細(xì)管吸取混合氨基酸溶液，點(diǎn)與兩線交點(diǎn)處,，點(diǎn)的直徑控制在2mm左右,，不可過大。待樣品干燥后再點(diǎn)一次,。濾紙上點(diǎn)樣斑點(diǎn)干燥后,，把濾紙卷成圓筒形，紙的兩邊以鉻絲相連,，但不可重疊相碰,。
2）、展層
在層析缸中平穩(wěn)的放入裝有*相層析溶劑的培養(yǎng)皿,。將圓筒形濾紙放入,，點(diǎn)樣一段接觸溶劑，以點(diǎn)樣處不浸入溶劑為準(zhǔn),。待溶劑自下而上均勻展開,，約2h后溶劑到達(dá)距紙邊0.5cm處取出濾紙，懸掛于室溫中,，用電吹風(fēng)充分吹近溶劑,。然后載去未走過溶劑的濾紙邊緣，將濾紙轉(zhuǎn)90度,，卷成如前圓筒狀,，放入盛第二相溶劑的層析缸內(nèi)展開，約1h后溶劑展開到距紙邊0.5cm時取出,，用電吹風(fēng)吹近溶劑使其干燥。
3）,、顯色
用噴霧器將茚三酮均勻地噴在濾紙上,，然后懸濾紙于65℃烘箱內(nèi)，烘30min,，即可看到紫紅色氨基酸斑點(diǎn),，將圖譜上的斑點(diǎn)用鉛筆圈出。用直尺量出各斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)的距離以及溶劑前沿與原點(diǎn)的距離,，求出各氨基酸的Rf值,。將各顯色斑點(diǎn)的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的Rf值比較，可得知該斑點(diǎn)的準(zhǔn)確成分,。
注意事項(xiàng)
（1）,、烘箱加熱溫度不可過高，且不可有氨的干擾,，否則圖譜背景會泛紅,。
（2）、*相溶劑在使用前再按比例混合，否則會引起酯化,，影響層析效果,。
（3）、整個實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)戴手套進(jìn)行,。