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基因分離克隆的方法
閱讀：226 發(fā)布時間：2016-5-20ELISA試劑盒基因芯片技術分離目的基因生物芯片是高密度固定在固相支持介質(zhì)上的生物信息分子的微列陣,。列陣中每個分子的序列及位置都是已知的，并按預先設定好的順序點陣,?；蛐酒巧镄酒囊环N，其上固定的是核算類物質(zhì),，主要用于DNA、RNA分析,。分為DNA芯片和微點陣兩種,。
分離目的基因是是指從基因組中發(fā)現(xiàn)或找出某個目的（標）基因。目前是通過①比較不同物種之間,，或同一物種不同個體之間,；或同一個體在不同生長發(fā)育是期或不同環(huán)境條件下基因差異表達（基因表達平行分析）來實現(xiàn)的。采用基因芯片技術進行基因差異表達研究可以通過雜交直接檢測到細胞中mRNA的種類及豐度,，與傳統(tǒng)的差異顯示相比具有樣品用量小,，自動化程度高，被檢測目標DNA密度大及并行種類多等優(yōu)點,。②利用同源探針從cDNA或EST微列陣中篩選分離目的基因,。目前有DNA芯片、cdna芯片兩種,。其基本步驟包括：基因芯片的制備,、靶樣品制備、雜交與檢測,、目的基因得分離并獲得全長,。
基因文庫技術分離目的基因基因文庫指某一生物類型全部基因的集合。這種集合是以重組體的形式出現(xiàn),。某生物DNA片段群體與載體分子重組,，重組后轉(zhuǎn)化宿主細胞，轉(zhuǎn)化細胞在選擇培養(yǎng)基上生長出的單個菌落（或噬菌斑,，或成活細胞）即為一個DNA片段的克隆,。全部DNA片段克隆的集合體即為該生物的基因文庫。其類型很多,，如可分為基因組文庫與cdna文庫,、克隆文庫與表達文庫，按載體分有智力文庫,、噬菌體文庫,、黏粒載體文庫,、人工染色體文庫等?；蛭膸鞓嫿ê?，從文庫中篩選基因的方法主要有以下幾種：核算雜交法、免疫學檢測法,、DNA同胞選擇法,、PCR篩選法等?；蛭膸斓臉嫿ㄊ悄壳盎蚬こ痰暮诵墓ぷ?，也是分離目的進的常用方法之一。
功能蛋白組分離目的基因蛋白組是指細胞內(nèi)全部蛋白的存在及活動方式,，即基因組表達產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱,。功能蛋白質(zhì)組指那些可能涉及到特定功能機理的蛋白質(zhì)群體。主要研究方法為蛋白質(zhì)雙向電泳,。通過液相色譜,、質(zhì)普對蛋白質(zhì)序列進行分析，在借用分子生物學的手段則可以進行目的基因的分離,。如：應用PCR進行分離目的基因：通過對蛋白質(zhì)的序列分析,，可以通過密碼子的簡并性設計簡并引物，可利用RT-PCR得到目的基因的全長,；應用核算雜交篩選法分離目的基因：即利用簡并寡核苷酸探針篩選cDNA或基因組文庫,；免疫雪篩選法分離目的基因：是通過蛋白的特異抗體與目的蛋白的專一結(jié)合，從表達文庫中分離目的基因的蛋白基因,。
PCR技術在基因克隆中的應用PCR技術已經(jīng)滲透到生物學的各個領域,，在分子克隆和獲得cDNA全長方面起著重要的作用。利用PCR技術對特定條件下基因的表達進行檢測即通過mRNA差別顯示（DDRT-PCR）可鑒定和分離出所需的目的基因,；通過RT-PCR克隆到目的基因的cDNA區(qū)域進行cDNA文庫的構建,，通過錨定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因調(diào)控區(qū)等?，F(xiàn)在可用于基因分離和克隆的PCR方法主要有：RT-PCR,，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小節(jié)）,，用于DNA序列克隆的Panhankle-PCR,、Cassette-PCR以及減法cDNA文庫的PCR法構建等。Panhankle-PCR,、Cassette-PCR為基因組已知DNA相臨未知序列的克隆奠定了良好的基礎,。
mRNA差別顯示技術分離差別表達基因mRNA差異顯示技術是對組織特異性表達基因進行分離的一種快速行之有效的方法之一。它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR技術結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術,。它利用5’錨定引物oligo（dT）12MN和3’端隨機引物對總mRNA進行PCR擴增,，以期得到差異表達的條帶,。并對其差異顯示的條帶進行回收、克隆,。