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嘌呤霉素篩選細(xì)胞的原理
閱讀：5796 發(fā)布時(shí)間：2016-5-9ELISA試劑盒嘌呤霉素(puromycin;PM ) 是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑,它具有與tRNA分子末端類似的結(jié)構(gòu),，能夠同氨基酸結(jié)合，代替氨?；膖RNA同核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合,，并摻入到生長的肽鏈中。用嘌呤霉素篩選細(xì)胞方法如下：
嘌呤霉素篩選細(xì)胞
轉(zhuǎn)染（24孔板進(jìn)行）或電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)24小時(shí),，按10%密度傳代（傳至36mm平皿）,，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞密度增至20%-25%回合時(shí),；
去掉培養(yǎng)液,，PBS洗一次，加入按照*嘌呤霉素篩選細(xì)胞的濃度（殺傷曲線試驗(yàn)確定）配制好的嘌呤霉素篩選細(xì)胞培養(yǎng)基2-3ml,。
根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞的存活情況,，每隔2天更換一次嘌呤霉素篩選細(xì)胞用培養(yǎng)基（培養(yǎng)基用量為2-4ml，細(xì)胞多,，多家培養(yǎng)基,，細(xì)胞少，少加培養(yǎng)基）,，一般在3-1天內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞大量或少量死亡情況（如果轉(zhuǎn)染效率或電轉(zhuǎn)效率高,，則死亡少；如果轉(zhuǎn)染率或電轉(zhuǎn)率低,，則死亡多,；如果篩選濃度偏低，嘌呤霉素篩選細(xì)胞培養(yǎng)基用量少,，細(xì)胞密度大于80%,，會(huì)導(dǎo)致大量假陽性克隆）,。如果少選*周,，出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡，則在原培養(yǎng)皿中繼續(xù)加入嘌呤霉素篩選細(xì)胞培養(yǎng)基篩選一周,；如果刪選*周,，出現(xiàn)細(xì)胞少量死亡，則把細(xì)胞按照10%密度傳代（傳至35mm平皿,，傳一個(gè)皿即可,，多余細(xì)胞丟棄），利用少選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選一周,；
篩選第二周結(jié)束后,，則把細(xì)胞消化下來。進(jìn)行重點(diǎn)稀釋（10ul培養(yǎng)基中含1個(gè)細(xì)胞,，用篩選培養(yǎng)基）,，把上述10ul細(xì)胞懸液假日96孔板中（提前加入40ul篩選培養(yǎng)基），伊紅加入24孔,，4小時(shí)候觀察每個(gè)孔的情況,。記錄只含一個(gè)細(xì)胞的孔，含有一個(gè)細(xì)胞的孔用于繼續(xù)篩選,，其余孔舍棄,；
根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況換入新的嘌呤霉素篩選細(xì)胞用培養(yǎng)基待細(xì)胞密度為80%時(shí),，將其傳代至24孔板中增殖，待細(xì)胞密度為80%時(shí),，將其傳代至6孔板中增殖,，待細(xì)胞密度為80%時(shí)，將其傳代至T25瓶（一傳3）中增殖,，每隔3天換液,。
細(xì)胞大量擴(kuò)增后，一瓶用于提取中RNA進(jìn)行QPCR檢測(cè),，一瓶用于總蛋白進(jìn)行WB檢測(cè),，另一瓶用于保種，根據(jù)QPCR和WB結(jié)果取舍陽性克隆,。
嘌呤霉素篩選細(xì)胞方法如上,，具體的嘌呤霉素篩選細(xì)胞讓發(fā)如上，嘌呤霉素穩(wěn)定性高,，可以常溫運(yùn)輸,，收到產(chǎn)品后4℃存放；
嘌呤霉素在室溫條件下可存放3個(gè)月,，4℃條件下保質(zhì)期一年,。為了達(dá)到的穩(wěn)定狀態(tài)和zui長的保質(zhì)期，存放于-20°C,，保質(zhì)期為2年,。
BAMBI 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白BAMBI抗體
BCL9 B淋巴細(xì)胞淋巴瘤因子9抗體
Biliverdin Reductase 膽綠素還原酶抗體
BIVM BIVM蛋白抗體
Blood Group Lewis a 血型Lewis A抗原抗體
Blood Group Lewis b 粘蛋白/巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3抗體
BLM Bloom綜合征相關(guān)蛋白抗體
BMP8b 骨形態(tài)發(fā)生蛋白8b抗體
phospho-BMX (Tyr566) 磷酸化非受體性蛋白酪氨酸激酶ETK抗體
phospho-BNIP3 (Ser95) 磷酸化促凋亡調(diào)節(jié)蛋白BNIP3抗體
BOB1 B淋巴細(xì)胞特異性激活OCT結(jié)合蛋白1抗體