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核酸抽提經(jīng)驗(yàn)及原理
閱讀：116 發(fā)布時(shí)間：2016-2-191、核酸抽提原理
簡(jiǎn)單地講,，核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟,。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分,，如蛋白質(zhì),、鹽及其它雜質(zhì)*分離的過程。 經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如 SDS,、Triton X-100,、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如Tris,、EDTA,、NaCl 等)。鹽的作用,，除了提供一個(gè)合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對(duì)核酸的破壞(如 EDTA),、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl)等,。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì),，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中,。裂解體系中還可能加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段,，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開,，同時(shí)，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑 (如GIT,、GuHCl 等) 裂解的,，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流,。 zui常用的純化方法,，一是PC 抽提 + 醇沉淀，二是介質(zhì)純化,。*種方法是利用 PC對(duì)裂解體系進(jìn)行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì),，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來,，實(shí)現(xiàn)核酸與鹽的分離,。第二種方法則是利用某些固項(xiàng)介質(zhì)，在某些特定的條件下,，選擇性地吸附核酸,，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離,。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是*種純化方法的一個(gè)變體,，省略了 PC操作的麻煩。當(dāng)然,，也有不純化的抽提方法,，但是用途多局限于簡(jiǎn)單的 PCR。其它雜質(zhì) – 如多糖,、多酚等 -的去除,，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑,，或者增加一些額外的步驟來實(shí)現(xiàn)的,。
2、了解你的實(shí)驗(yàn)樣品
如果你研究某個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品,，并且要抽提它的核酸,，以下的信息一定要先行收集：該樣品的核酸含量、酶含量,、特殊雜質(zhì)含量,。如果你對(duì)樣品的特點(diǎn)一無所知，當(dāng)樣品稍微有一點(diǎn)復(fù)雜時(shí),，抽提核酸的實(shí)驗(yàn)就會(huì)碰到許多問題,。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細(xì)胞的含量是人血的千倍左右,，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA,，怎么可能成功,？失敗了又怎么知道原因所在？同時(shí),，只有對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品有所了解,，才能正確選擇裂解方法。 絕大部分情況下,，使用新鮮樣品可以獲得的結(jié)果,。對(duì)一些雜質(zhì)含量高的樣品，如果使用新鮮樣品抽提基因組 DNA 是碰到雜質(zhì)殘留過大的問題,，可以試一下 -20C保存一天后再抽提的對(duì)策,，可能會(huì)有意想不到的效果。樣品如果因?yàn)槟承┰虮仨毾刃斜４?，也要先?jiǎn)化一下樣品：血液只保存有核細(xì)胞,；將樣品分割后保存，避免反復(fù)凍融,。如果實(shí)驗(yàn)室不具備合適的保存條件,，將樣品先裂解后再保存，是一個(gè)不錯(cuò)的選擇,。
3,、裂解方法的評(píng)價(jià)
含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因組 DNA 的,。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA相連接的蛋白質(zhì)的游離,。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對(duì)蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進(jìn)作用,；同時(shí),，巨大的基因組 DNA是很容易"纏"住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后,，則不容易被基因組 DNA"纏"住,，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使zui終獲得的基因組 DNA 的純度更高,。另外一個(gè)思路是,，如果基因組 DNA 與蛋白質(zhì)"纏"在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優(yōu)勢(shì),，則純化時(shí)以 DNA的形式被保留下來,，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢(shì),，則純化時(shí)以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致 DNA 的損失,。有些樣品,，如肌肉，即使是RNA 抽提,，也強(qiáng)烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個(gè)時(shí)候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)),，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的,。該方法是獲得zui大得率和zui高純度的基礎(chǔ),。 不使用蛋白酶的去污劑裂解方法,，仍然在細(xì)胞基因組 DNA抽提方面有優(yōu)勢(shì)，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇莦ui高,，而經(jīng)濟(jì)性及操作簡(jiǎn)單很重要時(shí),。控制好裂解液/樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵,。該方法結(jié)合高鹽沉淀,，可以實(shí)現(xiàn)zui簡(jiǎn)單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會(huì)比用 PC 抽提的差一些,。 高濃度蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法,，是抽提 RNA 的,。總 RNA 的抽提,，zui重要的是快速裂解細(xì)胞膜,，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)"纏"住的問題，因?yàn)槎疾粫?huì)對(duì)以后的純化產(chǎn)生大的影響,，可以不考慮,。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的 RNA酶,，從而確保了 RNA 的完整性,。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA的抽提,，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的,。該方法也可用于基因組 DNA 抽提，非?？焖俸?jiǎn)單,，但純度不是很高,。 含 CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品,，如細(xì)菌,、植物的基因組 DNA 抽提的裂解方法。該方法成功與否與兩個(gè)因素有關(guān)：一是 CTAB的質(zhì)量,，二是洗滌的*程度,。CTAB 的質(zhì)量對(duì)裂解效率有很大的影響，而且,，似乎還說不清楚原因,，因?yàn)榧词故峭还镜募兌纫粯拥腃TAB，批號(hào)不同,，效果就可能差別很大,。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時(shí),， CTAB的少量殘留也會(huì)對(duì)酶活性有巨大影響,，所以洗滌是否*也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時(shí)的溫度,，多使用65C,；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴(yán)重或者得率太低，可以試一下 37C – 45C 這個(gè)相對(duì)低溫的區(qū)域,。 SDS堿裂解法是質(zhì)粒抽提的裂解方法,，具有快速、得率高,、幾乎無基因組 DNA污染的特點(diǎn),。控制好裂解液/菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵,。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C 會(huì)更好一些,，所以，加入溶液 III 后在 4C靜置一段時(shí)間以及采用 4C 離心去蛋白質(zhì),，都可以提高質(zhì)量,。該方法不一定要使用 PC 純化，但結(jié)合 PC 純化,，可以獲得純度很高的質(zhì)粒,。RNA的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在zui后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml)來實(shí)現(xiàn)?？偟母杏X是,，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過,，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法*去除 RNA 殘留,。另外，對(duì)大質(zhì)粒(50 kb 以上),，該方法可能會(huì)有問題。 PCR模板的簡(jiǎn)易裂解方法,，也是使用面很廣的一類方法,。該方法的特點(diǎn)是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR,，非?？焖佟Ｒ舱?yàn)椴患兓?，所以,，假陰?(即沒有擴(kuò)增出來的陽性)比例也比較高。該方法zui簡(jiǎn)單的裂解液就是水,，復(fù)雜一點(diǎn)的就會(huì)含有一些不會(huì)抑制后續(xù)的 PCR 反應(yīng),，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制PCR 反應(yīng)雜質(zhì)的東西,，如 Triton X-100,、甲酰胺等。再?gòu)?fù)雜一點(diǎn)的就會(huì)含有諸如 Chelex 100之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì),。操作也非常簡(jiǎn)單,，多使用溫度的變化來實(shí)現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸,、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等,。該方法從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個(gè)樣品是陽性還是陰性,。降低樣品使用量可以提高陽性率,，因?yàn)闃悠妨康慕档停瑫r(shí)意味著 PCR 的抑制物量的降低,。 選擇了合適的裂解液,，下一步就是要控制好樣品與裂解液的比例。這個(gè)問題非常重要,，但卻沒有獲得足夠的重視,。嚴(yán)肅的參考資料，都應(yīng)該會(huì)提供一個(gè)簡(jiǎn)單的比例,，如1ml 裂解液可以用于 T mg 組織或者 C個(gè)細(xì)胞,；我的建議是，你的樣品量要小于資料所提供的,。起始樣品用多大,，并沒有具體的說法,。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實(shí)驗(yàn)所需的核酸量,，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ),，會(huì)比較合理的。不要因?yàn)?1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品,，就一定使用 100mg樣品,。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果 (純度及得率)沒有關(guān)系,，然而,，在實(shí)際操作中，對(duì)結(jié)果是有比較大的影響的,。裂解液的用量原則是：確保能*裂解樣品,，同時(shí)使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低,，將導(dǎo)致沉淀效率低,，影響得率；濃度過高,，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不*,，導(dǎo)致純度下降。另外,，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準(zhǔn)的,，而不是以核酸含量為基準(zhǔn)，這一點(diǎn)務(wù)必牢記,。
4,、純化方法
評(píng)價(jià) PC 抽提/醇沉淀方法，是一個(gè)過時(shí)的方法,。穩(wěn)定,、可靠、經(jīng)濟(jì),、方便,。PC抽提可以*去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽,，對(duì)于一般的干凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì)),，該方法*可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次 PC抽提都會(huì)損失一部分核酸(因?yàn)椴豢赡軐⑺嗳恳迫?,，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低,，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的zui大的問題是不適合大規(guī)模抽提。 PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一個(gè)非常有效的手段,。苯酚能使蛋白質(zhì)變性,，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間,。PC抽提的關(guān)鍵是,，一要混勻*，二要用量足夠,。*混勻,，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)*變性,。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會(huì)對(duì)核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞,，實(shí)際上大可不必如此小心,。劇烈的混勻操作，是會(huì)部分打斷大分子的基因組 DNA,，但該破壞作用不會(huì)強(qiáng)烈到 DNA變成 10kb 以內(nèi)的小片段,。手劇烈晃動(dòng)混勻后，基因組 DNA 的片段,，大部分會(huì)大于 20kb,，這個(gè)大小，除了一些特別的要求外,，對(duì) PCR和酶切,，都是*適用的。如果要求的片段非常大,，如構(gòu)建文庫用,，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻 –此時(shí)的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大,，使體系不要太粘稠,。用量要足夠，是因?yàn)楸椒尤コ鞍踪|(zhì)是有一定的飽和度的,。超過了該飽和度,，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會(huì)被一次去除，必須靠多次抽提,，方可*去除,。另外，體系太粘稠的壞處是,，蛋白質(zhì)難以*去除,，以及基因組 DNA會(huì)斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C 離心操作有利于更*去除蛋白質(zhì),。PC 抽提的另外一個(gè)用途是,，利用酸性酚可以部分去除 DNA的特點(diǎn)，在 RNA 抽提時(shí)獲得 DNA 殘留極少的 RNA,。不過有一點(diǎn)要提醒的是,，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前,，是不能使用 PC抽提的,，否則核酸必定降解。 高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法,，同樣也是一個(gè)非常不錯(cuò)的方法,。與 PC抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點(diǎn)外,，該方法幾乎克服了 PC抽提的所有缺點(diǎn),。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是,，可以用于大規(guī)模抽提,，不足是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C會(huì)更好一些,。 介質(zhì)純化方法,，是一個(gè)越來越受到重視的方法。其zui大特點(diǎn)是非常適合大規(guī)模核酸抽提,，并且因?yàn)槭苋藶椴僮饕蛩赜绊懶?，純度的穩(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC純化方法更高)。其致命弱點(diǎn)是樣品過量,。介質(zhì)可以分為兩大類,，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里,；另外一類則是顆粒狀(如Glassmilk,、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大,，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程,，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸,。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程,，但因?yàn)榧尤氲囊后w通過離心后會(huì)進(jìn)入另外一個(gè)離心管中，與含有核酸的柱子*是分開的,，所以洗滌更*,，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了,，或者液體的殘留)。不過,，介質(zhì)純化方法的成本是zui高的,。
5、醇的沉淀
醇的沉淀,，目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來,，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 –的分離。實(shí)際操作中,，許多雜質(zhì)也會(huì)與核酸一起被醇沉淀下來,，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時(shí)候。醇的沉淀并不是非常特異性的,，任何有機(jī)大分子及一些鹽,，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來,。 就核酸而言,，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是*的或者醇的比例是不可更改的,。實(shí)際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達(dá)到一定水平后,，即使體系中不含教科書中建議的鹽,，單獨(dú)使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽,，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來(當(dāng)然,，得率可能會(huì)降低)。知道這一點(diǎn)的意義在于：不要迷信標(biāo)準(zhǔn)方法的*性,；相反,，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題 – 主要是純度問題 –時(shí)，*可以通過調(diào)整沉淀?xiàng)l件來改善,。zui有參考價(jià)值的是 TRIzol提供的一個(gè)沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇,，可以大大降低多糖殘留。另外一個(gè)問題就是,，要堅(jiān)信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程,；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會(huì)降低核酸的得率,，但因?yàn)榭梢源蟠筇岣呒兌取?如果核酸抽提的起始樣品是比較"臟"的,，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時(shí),，效果明顯,；當(dāng)核酸濃度比較高時(shí),，效果不明顯，但卻會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加,。 醇沉淀使用異丙醇還是乙醇,，我沒有發(fā)現(xiàn)這二者對(duì)質(zhì)量有大的影響，雖然許多人"發(fā)現(xiàn)"乙醇沉淀的核酸純度更高,。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊,，帖壁緊，顏色不是很白,；乙醇沉淀的核酸比較蓬松,，容易從壁上移動(dòng)，顏色比較白,。這是現(xiàn)象,，提示結(jié)論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌,。結(jié)合丟失和洗滌兩個(gè)方面綜合考慮,，則建議：少量核酸用異丙醇沉淀 (量少，洗滌不是問題,，不丟失為先),，大量核酸用乙醇沉淀(量大，丟失不是問題,，洗滌方便為先),。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我沒有碰到過(我?guī)缀醪皇褂玫蜏爻恋?，難道低溫沉淀比較容易出現(xiàn)鹽沉淀,？)；我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不*,。 當(dāng)然,，也不要忘記異丙醇沉淀的zui大優(yōu)點(diǎn)是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml離心管內(nèi)完成,。但由于其沉淀物很緊湊,，洗滌時(shí)其中心部分不容易被洗滌到，所以,，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來,，一定要放置一段時(shí)間使沉淀zui終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次,，質(zhì)量決不會(huì)有問題的,。 PEG、LiCl,、CTAB 都可以用于核酸沉淀,。雖然它們遠(yuǎn)沒有醇沉淀的高使用頻率,，但卻各有特點(diǎn)。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA,，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來,。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。
6,、洗滌
洗滌首先一定要將沉淀懸浮起來,；第二就是要有一定的時(shí)間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時(shí)(使核酸沉淀zui終蓬松),；第三是少量多次,；第四則是去上清要*。教科書中的操作基本上都是"倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻",，這一描述本身沒有問題,，且十分方便，但因?yàn)樗麃碜試?guó)外,，自然就有了"水土不服"的問題,。如果離心管是經(jīng)過硅化的，因?yàn)橐后w幾乎不掛壁,，所以上清可以去除得非常*,；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化,，殘留量也非常少,，也沒有什么問題；差的管子,，液體的掛壁非?？捎^,，其殘留量多到會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn),。*不受管子質(zhì)量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心,，將殘液用移液器吸出,。一定要牢記的是,，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì),，其殘留量與混勻程度,、核酸沉淀的大小都有關(guān),。揮發(fā)時(shí)去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會(huì)被揮發(fā)去除的,。 另外,，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強(qiáng)度。沉淀越大,，裂解液的裂解能力越強(qiáng)，洗滌越要*：放置時(shí)間相對(duì)要長(zhǎng)一點(diǎn)，洗滌次數(shù)也要考慮增加。zui關(guān)鍵的,，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇,。
7,、核酸的溶解和保存
純化后的核酸，zui后多使用水或者低濃度緩沖液溶解,；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA溶解方法多提倡使用 TE 溶解,，認(rèn)為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風(fēng)險(xiǎn),；如果操作過程控制得當(dāng),，DNase的殘留幾乎是可以忽略的,，*可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA,。 基本上,，核酸在保存中的穩(wěn)定性,，與溫度成反比,，與濃度成正比,。雖然也有部分實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)，-20C 保存的 DNA 比 -70C 保存的穩(wěn)定，我卻寧可認(rèn)為這是個(gè)例,。 如果溫度合適,，保存中核酸發(fā)生降解或者消失,，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解,，第二個(gè)原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適
導(dǎo)致的水解 (RNA在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適),。還有一個(gè)不為人重視的,，就是 EP管對(duì)核酸的影響。首先一定要堅(jiān)信一點(diǎn),，那就是核酸一定會(huì)與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng),，達(dá)到某種均衡。EP管的材質(zhì),，首先可能吸附核酸,，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性,。在核酸的濃度比較高時(shí),，這個(gè)現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時(shí),，則比較明顯了,。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實(shí)驗(yàn)所證明,，但許多實(shí)驗(yàn)人員并沒有將該建議當(dāng)回事,。 現(xiàn)在 EP 管的材料遠(yuǎn)多于過去。這些新出現(xiàn)的材料,，在強(qiáng)度,、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特征，尤其是對(duì)核酸穩(wěn)定性的可能影響,，遠(yuǎn)沒有研究透徹,。正如現(xiàn)在的質(zhì)粒可以改造得越來越適用某些要求一樣,，其負(fù)面產(chǎn)物可能是,，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn) denatured cc ,、multimeric forms of cc 等等帶型,。
8、核酸質(zhì)量的檢測(cè)問題
將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn),，是*可靠的檢測(cè)方法,；除此之外的檢測(cè)方法，都是相對(duì)的,，而且并不十分可信,。目前用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)核酸質(zhì)量的方法，一是電泳,，二是紫外分光光度儀,。電泳檢測(cè)的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出電泳分離范圍),，該方法還是非?？尚诺模浑娪具€可以用于估計(jì)核酸的濃度,，但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān),；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息,，但是同樣與經(jīng)驗(yàn)有關(guān),。紫外分光光度儀檢測(cè)的是純度和核酸含量，然而,，由于紫外分光光度儀不能確保非常準(zhǔn)確,，而該儀器的靈敏度又非常高，所以,，提供的結(jié)果并不十分可信,。一般講，同時(shí)進(jìn)行紫外和電泳檢測(cè),，綜合二者的結(jié)果,，可以做出一個(gè)更合理的判斷。但由于這兩個(gè)方法都有缺陷,，所以,，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),，也不用大驚小怪。 關(guān)于紫外分光光度儀的檢測(cè),。首先,，不要使用不能選擇波長(zhǎng)的儀器；使用那些已經(jīng)固定了波長(zhǎng)的儀器,，大概可以算是你夢(mèng)魘的開始,。(沒有信息是可怕的,，更可怕的是將錯(cuò)誤的信息當(dāng)真,。)其次，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器,；調(diào)較可以使用非常純的自備核酸,，也可以使用苯酚 (后者是我目前每次都使用的方法，非常簡(jiǎn)單,；具體道理可以見我以前的帖,。)zui后，要記住讀數(shù) A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 為 1.8) : 1為理論上的數(shù)據(jù),，實(shí)際測(cè)定時(shí)會(huì)有一些差別,；但如果差別太大，就有問題了,。有兩個(gè)值得商榷的觀點(diǎn)：如果 A260/A230 > 2就是純的,，如果 A260/A280 > 2.3 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大許多,，一定是有雜質(zhì)殘留的(具體是什么雜質(zhì)我不知道),。如果核酸抽提好后立即就測(cè)定，A260/A280 > 2.3 決不提示核酸降解,，原因是：那些能導(dǎo)致A260/A280 > 2.3 的核酸片段非常小,，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你儀器提供的 A260/A280實(shí)際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值,。純的核酸的吸光值,，在 A230 是谷底，在 A260 是峰頂,，在 A280則正好是半山坡,。根據(jù)曲線在底和頂?shù)男甭蕑ui小，在半山坡的斜率zui大的特點(diǎn),，不難得出如下結(jié)論：A230 和 A260的讀數(shù)受儀器準(zhǔn)確性的影響比較小,，而 A280 受儀器準(zhǔn)確性的影響比較大。 建議先電泳檢測(cè),，再用紫外分光光度儀檢測(cè),。電泳后,，可以看到哪些樣品根本就不能用 (如降解太厲害)，以及核酸的大致濃度,，這樣就為紫外分光光度儀的檢測(cè)提供了一個(gè)參考 (降解的不必要測(cè)了,，要測(cè)的該取多少量等)。
9,、問題解答
A 抽提過程中的現(xiàn)象及可能的原因 I：核酸不溶解或者難溶解 – 蛋白質(zhì)殘留 (雖然目前更多的資料強(qiáng)調(diào)的是過分干燥所致,。)。75%乙醇洗滌后,，如果是空氣干燥,，幾乎不可能過分干燥的，尤其是在南方潮濕的地方,。佐證實(shí)驗(yàn)：撕取少量 Merck 的絲狀CT DNA到一個(gè)離心管中,，加入無水乙醇；10 分鐘后*去除乙醇,；待乙醇*揮發(fā)后,，加入 TE，10 分鐘后溶液就非常均勻而粘稠了,。 II：使用異丙醇沉淀核酸,，沉淀為白色 – 多糖殘留。 III：核酸溶解后為乳白色 – 多糖殘留,。 IV：75% 乙醇洗滌異丙醇沉淀的核酸時(shí),，沉淀變大了 – 見 10-III。
B 紫外檢測(cè) I：A260/A280 比值低 – 蛋白質(zhì)殘留,。但如果操作過程中使用了苯酚,，則更可能是苯酚殘留。 II：A260 值提示的含量與電泳檢測(cè)時(shí)提示的含量有可見的誤差 – 苯酚殘留,。
C 電泳中的現(xiàn)象及可能的原因 I：加樣孔有熒光 – 首先一定有 DNA 的滯留,；其次多含蛋白質(zhì)殘留；如果是比較特殊的樣品,，其雜質(zhì)也可能導(dǎo)致熒光,。蛋白質(zhì)幾乎不會(huì)被 EB染色，能出現(xiàn)熒光,，則一定含有核酸,。非常巨大的基因組DNA (>50kb)，如果使用普通的瓊脂糖電泳,，往往不能電泳出孔,，單獨(dú)就可能滯留在加樣孔中產(chǎn)生熒光。更多的時(shí)候,，是比較大的 DNA與殘留的蛋白質(zhì)結(jié)合后,，電泳不能出孔而在孔中產(chǎn)生熒光,。酶反應(yīng)產(chǎn)物，如果沒有經(jīng)過純化去除酶,，也非常容易在孔中出現(xiàn)熒光,，其原因是酶與核酸幾乎都有比較強(qiáng)的結(jié)合能力 (基因組 DNA 的PCR產(chǎn)物電泳往往在孔中都有熒光，而且熒光強(qiáng)度與體系的特異性成反比,。),。如果是植物樣品，還可能由其它雜質(zhì)殘留引起,。我的經(jīng)驗(yàn)是：蛋白殘留的熒光有點(diǎn)發(fā)悶,，其它雜質(zhì)殘留亮得很刺眼，且薄得銳利,。 II：總 RNA 非變性電泳顯示過多的條帶 – 根本就不是問題,。 III：總 RNA 非變性電泳顯示 28S 不如 18S 亮,，但條帶清晰無彌散 – 多提示 28S 沒有被 EB 飽和,。RNA 殘留多時(shí)，基因組 DNA 的電泳也會(huì)有相似現(xiàn)象,。簡(jiǎn)單的補(bǔ)染可以解決此問題,。再次電泳時(shí)，或者降低上樣量,，或者增加膠中 EB 的量,。
D 降解的現(xiàn)象、原因及對(duì)策 降解的現(xiàn)象,，如果拋開問題電泳所致,，可以簡(jiǎn)單總結(jié)如下：主帶不再突出，向小片段方向發(fā)生彌散,，亮度比較均衡地衰減,。如果同時(shí)還伴隨下列的一個(gè)或者多個(gè)現(xiàn)象，則需要更進(jìn)一步的檢測(cè)：加樣孔非常的亮,、彌散發(fā)生在主條帶位置的上下兩個(gè)方向,、從加樣孔即開始發(fā)生彌散。 以現(xiàn)在的裂解液的裂解能力而言,，降解的發(fā)生主要是在*勻漿之前,，只有極少量由不干凈的溶解液導(dǎo)致。以總 RNA 抽提為例,，本站就有帖總結(jié)為：總RNA 的質(zhì)量由高到低依次為懸浮細(xì)胞,、貼壁細(xì)胞、組織(此處的質(zhì)量不僅指純度,，也指完整性才對(duì)),。*裂解懸浮細(xì)胞的時(shí)間zui短,，*裂解組織的時(shí)間zui長(zhǎng)，這就是降解多發(fā)生在*勻漿之前的一個(gè)佐證,。再看一看新鮮樣品和冷凍保存樣品,，非常嚴(yán)格的冷凍保存和勻漿操作的確可以確保冷凍樣品的核酸的質(zhì)量；但是,，有許多實(shí)驗(yàn)室并不具備嚴(yán)格的保存手段,，實(shí)驗(yàn)人員的操作也并非，其結(jié)果就是核酸的降解,。RNA 抽提受的影響因素太多,，就以基因組 DNA 的抽提為例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K的溶液,，無論你使用的是新鮮樣品還是冷凍保存樣品,，如果混勻*，可以預(yù)期的降解為：細(xì)胞 – 不應(yīng)該降解,，碾碎的組織 – 不應(yīng)該降解,，大塊組織(包括鼠尾) –部分降解。如果電泳發(fā)現(xiàn)新鮮的細(xì)胞和碾碎的新鮮組織發(fā)生了降解現(xiàn)象,，該現(xiàn)象是假象,；如果電泳發(fā)現(xiàn)冷凍的細(xì)胞和碾碎的冷凍組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象不是假象,，就是樣品在保存中已經(jīng)降解了,。說得更一點(diǎn)，即使蛋白酶 K 失活了,，消化試劑的裂解能力也足以保證細(xì)胞的基因組 DNA在抽提過程中間不被降解,。 減少或者杜絕核酸降解，一定要將重點(diǎn)放在樣品被*勻漿之前,。樣品的保存在前面已經(jīng)說過了,，不重復(fù)。其次就是要縮短樣品從脫離原來的生存環(huán)境或者低溫到被*勻漿之間的時(shí)間,。
E 后續(xù)酶反應(yīng)失敗 資料書中連篇累牘的原因我就不說了,，因?yàn)槎紝?duì)。我相信因?yàn)榇蠹沂紫认嘈诺木褪撬鼈?，所以碰到問題首先一定會(huì)從那些方面著手,。如果三次實(shí)驗(yàn)后，問題還沒有解決,，那么 90%的可能在于洗滌方式的不嚴(yán)格導(dǎo)致的小分子物的殘留,。小分子物像刀，可以陸續(xù)"殺"死很多酶,；大分子物如蛋白質(zhì),，像繩子,，只能"捆住"一個(gè)目的核酸或者酶。更嚴(yán)格的洗滌可以解決該問題,。
F 蛋白質(zhì)是如何殘留的 PC 純化：a-取上清時(shí)取到中間層及下層,；b- PC 用量不足；c-混勻不*,；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白質(zhì),。 高鹽沉淀：a-取上清時(shí)取到了蛋白沉淀；b-裂解不*,；c-裂解液用量不足,，使裂解體系太粘稠；d-溶解度問題 (可以使用低溫沉淀加以改善),。 介質(zhì)：a-裂解不*,；b-裂解體系太粘稠。
G 小分子物質(zhì) (苯酚,、鹽) 是如何殘留的 醇沉淀：洗滌不*,。其原因與管子、操作手法等有關(guān),。 介質(zhì)：顆粒狀介質(zhì)的原因與醇沉淀相同,。柱式的幾乎都是柱子設(shè)計(jì)上的缺陷所致,，極少數(shù)由操作者未嚴(yán)格按要求操作所致,。
10、某些我使用的操作手法
實(shí)驗(yàn)做多了,，的確希望能偷點(diǎn)懶,；偷懶也有講究，否則就是偷雞不成失把米,。下面就是一些在確保抽提成功前提下的通用操作方法,；有些看起來很麻煩，但請(qǐng)想一想抽提失敗后的再次抽提,，應(yīng)該是可以算偷懶的方法了： I：混勻操作 (1.5ml 離心管內(nèi)) – 如果液體體積在 100ul 以內(nèi),，用指頭彈擊尖底混勻；在100-400ul 之間,，用振蕩器混勻,；大于400ul，用手晃動(dòng)混勻：晃動(dòng)時(shí)使離心管底永遠(yuǎn)處于斜上位置,，頻率要快,。 II：PC 抽提時(shí)上清的移取 – 離心管傾斜，根據(jù)上清的量選擇不超過 200ul 的移液器,，在外面先壓下移液器,，再將 tip 移入上清,。Tip 要盡可能靠近液面，tip 的尖嘴接觸內(nèi)壁,，緩緩松手吸取上清,。可多次移取,，但決不要使用 1ml 移液器,。 III：核酸的洗滌 – 核酸沉淀后離心，將上清倒掉,。如果核酸是來源于雜質(zhì)比較多的樣品 (如植物,、動(dòng)物肝臟、細(xì)菌等),，則在加入 75%乙醇之前,，再將離心管短暫離心后，用移液器將殘留液體*吸出,，否則,，75% 的乙醇非常容易將殘留液體中的多糖等雜質(zhì)給沉淀下來。移取 75%乙醇使用一次性的塑料吸管,，加入后將核酸*懸浮起來,，置于室溫一段時(shí)間 (時(shí)間長(zhǎng)短取決于沉淀大小)，期間多混勻幾次,。如果去除 75%乙醇的操作是"離心后倒掉再短暫離心后吸出殘留液體",，則洗滌 2 次；如果去除 75% 乙醇的操作是"離心后倒掉",，則洗滌 3次,，但zui后一次仍然采用"離心后倒掉再短暫離心后吸出殘留液體",。這樣洗滌的目的,，是確保小分子物的殘留低于 10 萬分之一 (zui大殘留不高于10uM 級(jí)),。
11、一些特別的問題
a：EP 管的問題 幾乎沒有人會(huì)認(rèn)為 EP 管的質(zhì)量會(huì)與核酸抽提的操作有關(guān),，與某些現(xiàn)象 (如核酸在 -20C 保存一天后發(fā)生了降解) 有關(guān)系,，但事實(shí)是，EP 管的質(zhì)量的確與核酸抽提的質(zhì)量以及核酸保存時(shí)的穩(wěn)定性有關(guān),。 硅化可以提供zui高質(zhì)量的 EP 管,，使某些奇怪的現(xiàn)象消失或者大大減輕。zui糟糕的 EP 管對(duì)液體有較強(qiáng)的吸附力,，在傾倒液體時(shí)殘留多,，核酸在管中保存的過程中會(huì)發(fā)生變性。這樣的管子是很有市場(chǎng)的，因?yàn)楸阋?；而正因?yàn)楸阋?，其材料總是不令人放心的?我個(gè)人認(rèn)為，只有硅化過的 EP 管,，才可能按照標(biāo)準(zhǔn)操作獲得滿意的結(jié)果,。否則，某些操作步驟必須調(diào)整,，才可以獲得穩(wěn)定的質(zhì)量,。
b：核酸抽提中的溫度問題 核酸抽提中的溫度問題，也是一個(gè)值得關(guān)注的問題,。首先要明確的一點(diǎn)是,，任何一個(gè)溫度條件，對(duì)某些方面有利,，同時(shí)也一定會(huì)有不利的一面,。如沉淀，低溫操作會(huì)提高得率,，但也會(huì)增加雜質(zhì)的殘留,。任何一步操作該用什么溫度為好，應(yīng)該是利弊權(quán)衡的結(jié)果,?；旧希艘恍┨厥獾牟襟E,，如消化等外,，用室溫是的選擇。那些認(rèn)為"低溫操作可以防止或者減少降解"之類的理由,，并沒有多少可操作性的,。低溫的確可以減低酶的活性，但低溫同時(shí)也降低了這些酶被裂解液中的試劑滅活或者抑制的速度,，此消彼長(zhǎng)，沒有辦法給出結(jié)論的,。就 RNA 抽提而言,，*勻漿前在冰上操作可以降低 RNA 被降低的風(fēng)險(xiǎn)，*勻漿后的溫度對(duì)RNA 的完整性影響已經(jīng)不會(huì)大的,；如果發(fā)現(xiàn)影響很大,，說明 RNase沒有被裂解液有效抑制，提示裂解液的用量不足,。更沒有道理的是認(rèn)為低溫沉淀和低溫洗滌可以防止降解了,。事實(shí)上，核酸一旦被沉淀下來，對(duì)酶的耐受力是很強(qiáng)的,，這就是核酸保存在醇溶液中zui穩(wěn)定的理論基礎(chǔ),。如果說沉淀使用低溫還可以提高得率，洗滌使用低溫又是為什么,？*的錯(cuò)誤而已,。
c：如何閱讀操作手冊(cè) 拿到操作手冊(cè)后，要倒著閱讀：先閱讀問題解答,，再看操作步驟下面的說明,，再看操作步驟。問題解答是別人在使用過程中曾經(jīng)碰到過的問題集錦,，操作步驟下面的說明是商家的警告,。沒有一個(gè)商家會(huì)將他的操作步驟寫得非常復(fù)雜，因?yàn)檫@是滿足使用人員習(xí)慣的結(jié)果,。一句話,，PS 和 By the Way之類的話中含有真正的有用素材。
12,、延伸的思考
a：標(biāo)準(zhǔn)化的概念 所謂的標(biāo)準(zhǔn)化,，指的是一套程序，確保不同的人能獲得質(zhì)量接近的產(chǎn)物的程序,。標(biāo)準(zhǔn)化并不是以獲得zui高質(zhì)量為目標(biāo),，而是以穩(wěn)定為目標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)化的核心是質(zhì)控,。 事實(shí)上,，核酸抽提的每一步操作，都有一個(gè)核心,；重要的是找到可觀察的指標(biāo)或者現(xiàn)象作為參考,，從而確保實(shí)驗(yàn)的成功。如懸浮的核心是沒有塊狀物的存在,，*消化的核心是沒有塊狀物的存在,，PC 抽提的核心是混勻-兩相成為乳狀，取上清的核心是用小一點(diǎn)的移液器移取液體,，吸取時(shí) Tip的尖頭盡可能接近液面,，吸取速度要慢，并且要留下 1mm以上的液體不要再吸,。去上清的核心是先倒空,，再短暫離心將殘留液體離到管低，用移液器*移出,。洗滌的核心是*懸浮沉淀,，并且要放置一段時(shí)間(時(shí)間長(zhǎng)短與沉淀大小有關(guān)) 使沉淀內(nèi)部也能被洗滌到。按這樣的方法抽提的核酸，其質(zhì)量是非常穩(wěn)定的,。 柱離心式實(shí)際上就是非常標(biāo)準(zhǔn)化的核酸沉淀與洗滌的操作,。一般而言，如果嚴(yán)格按照操作步驟去做了,，柱式操作出問題,，系統(tǒng)性的與試劑盒有關(guān)，偶然性的與操作有關(guān),。這一點(diǎn),，應(yīng)該是可以理解的。 一個(gè)方法,，其標(biāo)準(zhǔn)化程度越高,，其穩(wěn)定性就越好。步驟越少,，標(biāo)準(zhǔn)化就越容易,。產(chǎn)品的開發(fā)也要以高標(biāo)準(zhǔn)化程度為目標(biāo)。
b：QC 的概念 QC(質(zhì)控) 概念遠(yuǎn)沒有 QT (質(zhì)檢) 概念深入人心,。zui高境界的產(chǎn)品追求的是免檢,，或者是Trouble-free。另外,，現(xiàn)在的許多產(chǎn)品也是不允許 QT 的 (因?yàn)槭且淮涡缘?,，因此就只能靠 QC 來保證質(zhì)量了。QC是將精力集中在過程中：原料,、操作等,。只要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)去做，zui終的結(jié)果就有保證,。事實(shí)上,，很多實(shí)驗(yàn)人員是不做檢測(cè)而直接將抽提好的核酸用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的；他們之所以可以這么做,，是因?yàn)樗麄冇幸鉄o意之中非常的注意 QC,。也有不少人，尤其是新手,，Pay no attention toQC,，只知道zui后的 QT。一旦發(fā)現(xiàn)問題,，就去逆推原因,；但因?yàn)檫^程中所出現(xiàn)的現(xiàn)象根本就沒有注意，幾乎不可能準(zhǔn)確找出真正的原因的,。如果 QC做得好,，zui后的 QT 是否全部做/部分做/*不做,，取決于時(shí)間,、經(jīng)驗(yàn)、后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成本等因素,。
c：其它 核酸抽提的每一步操作,，都是利弊權(quán)衡的結(jié)果。消化要*,，時(shí)間就會(huì)長(zhǎng),；PC抽提時(shí)多取上清，得率會(huì)提高,，但增加了蛋白質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn),；沉淀使用低溫且延長(zhǎng)時(shí)間，得率會(huì)提高,，但增加了雜質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn) …不足詳列,?？傊?，核酸抽提是藝術(shù),，可以根據(jù)自己的樣品及當(dāng)時(shí)的情況，對(duì)操作步驟進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化,。elisa試劑盒
d：實(shí)驗(yàn)的思維 核酸抽提的成功,，就是每一步都沒有失敗。這不是玩文字游戲,，而是告訴你做實(shí)驗(yàn)的良好思維,。就如同小學(xué)基礎(chǔ)沒有打好，早晚會(huì)發(fā)現(xiàn)大問題一樣,，做實(shí)驗(yàn)決不要以成功為喜悅,，以失敗為痛苦。要保證實(shí)驗(yàn)成功,，不能有"這個(gè)操作應(yīng)該沒有問題",，"用這個(gè)可能不會(huì)有問題"之類的僥幸心理。去掉任何一個(gè)可能使實(shí)驗(yàn)失敗的因素,，這才是實(shí)驗(yàn)該有的出發(fā)點(diǎn),。用這樣的出發(fā)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)幾乎沒有不成功的,，所以說,，實(shí)驗(yàn)成功沒有什么快樂；實(shí)驗(yàn)的快樂來自于：發(fā)現(xiàn)自認(rèn)為不會(huì)導(dǎo)致失敗的某因素實(shí)際會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗,。學(xué)到了這樣的知識(shí)，才有快樂的理由,。
e：EB 在 NA 抽提中的運(yùn)用 EB 在 NA抽提中的應(yīng)用，用于電泳,，人皆盡知,；用于 gDNA 抽提時(shí)提高蛋白質(zhì)與 gDNA 的分離效率，卻似乎沒有人再考慮了,，因?yàn)榇蠹叶寂率褂?EB,。在NA 抽提中涉及到 EB 的另外一大類，就是膠回收操作了,；EB 在膠回收中扮演的角色,，就不*是正面的。 如果 NA 與 EB充分接觸,，EB 就會(huì)以每隔數(shù)個(gè)堿基的頻率均勻地插入 NA 之中,。EB的這種插入，無疑更可能破壞核酸雙鏈的穩(wěn)定性,，使核酸由雙鏈變成單鏈的壓力增加。如果核酸比較短,，而錯(cuò)配又多(錯(cuò)配的后果之一也是核酸容易由雙鏈變成單鏈),，EB 的插入將更容易導(dǎo)致變性的出現(xiàn),。這個(gè)觀點(diǎn)有如下的實(shí)驗(yàn)報(bào)告佐證：有相當(dāng)部分的 PCR產(chǎn)物膠回收實(shí)驗(yàn)，都報(bào)告說回收后的電泳結(jié)果是：目的條帶變淡或者消失,，同時(shí)出現(xiàn)了一條小的原來不存在的條帶。 壇中曾有文描述他做膠回收的程序：兩邊加 Marker,，中間加產(chǎn)物,；電泳過程不含 EB。電泳結(jié)束后，縱向割下 Marker 條帶用 EB染色后,，放回膠原來的位置,。開紫外，根據(jù) Marker的位置割下目的條帶,，再回收,。這是個(gè)笨辦法，但這樣使用的人一定是聰明人,。如果這個(gè)辦法仍然不能消除變性,，則只能使用高保真的酶了。
f：蛋白質(zhì)殘留的影響問題 (探討,，沒有證據(jù)) 一直對(duì)蛋白質(zhì)殘留不抱好感,，卻也沒有將它看成威力無比。本節(jié)考慮的是蛋白質(zhì)對(duì)酶反應(yīng)的影響問題,，為方便表述,，我將殘留的蛋白質(zhì)分成同源的 (與核酸或者酶有同一或者相似的來源，如細(xì)菌) 和異源的(與核酸或者酶沒有同一或者相似的來源) 兩種,。 先看異源蛋白質(zhì)的影響：內(nèi)切酶幾乎都在保存液中添加有 500ug/ml 的 BSA,，BSA 是改善 PCR 結(jié)果的一個(gè)選項(xiàng)，BSA是穩(wěn)定低濃度核酸的一個(gè)選項(xiàng),。幾乎都是正面的,。可以看到,，異源蛋白質(zhì)對(duì)酶反應(yīng)沒有抑制作用,，甚至還有促進(jìn)作用 (雖然都是以 BSA 為例)。 再看同源蛋白質(zhì)的影響：AMBION 公司有一個(gè)非常有特點(diǎn)的產(chǎn)品 "Cells-to-cDNA Kit",。細(xì)胞裂解后不去除蛋白質(zhì)就直接用于RT-PCR,。該例子應(yīng)該可以說明，與核酸同源的蛋白質(zhì)的殘留對(duì) RT-PCR不一定有影響,。另外一個(gè)例子是質(zhì)粒的酶切,。質(zhì)粒酶切是比較容易出現(xiàn)一些靠 PC 純化一次就可以解決的問題的,；因?yàn)?PC純化基本上就是去除蛋白質(zhì)，所以可以認(rèn)為質(zhì)粒抽提中殘留的蛋白質(zhì)對(duì)酶切是有巨大影響的,。各位看官是否注意到這兩個(gè)例子的zui大區(qū)別在什么地方,？區(qū)別在于殘留的蛋白質(zhì)究竟是與核酸同源還是與蛋白質(zhì)同源。事實(shí)是,，質(zhì)粒抽提中殘留的蛋白質(zhì)是宿主菌的 (Ecoli或者其它),，與質(zhì)粒并不同源；而內(nèi)切酶卻是來自于 Ecoli 或者其表弟表妹的,，與宿主菌的蛋白質(zhì)同源性是非常高才對(duì),。還有一個(gè)現(xiàn)象：EcoR I的 Star Activity 是zui明顯的，其它來源于 Ecoli 的酶的該活性也不差,，這是為什么,？ 寫到這，我頭有點(diǎn)痛了,，因?yàn)槲覜]有辦法證明,；就是有人提供了證明，我暫時(shí)也看不到用途,。畢竟,，酶反應(yīng)不是受單一因素影響的。如果說該思考有什么現(xiàn)實(shí)意義,，那就是：殘留蛋白質(zhì)的危害可能被夸大,；許多實(shí)驗(yàn)在重復(fù)失敗，只是因?yàn)槟阕プ〉南右煞覆皇钦鎯?。更大膽的假設(shè)是：BSA 可以用于某些核酸抽提,，以更*去除與酶同源的蛋白質(zhì)殘留。
g：無介質(zhì)的核酸抽提裂解液 (不含苯酚) 的展望 (供核酸抽提產(chǎn)品商及潛在的商參考) 經(jīng)典的醇沉淀和洗滌,，在無介質(zhì)核酸抽提技術(shù)中,，幾乎是*的，盡管微調(diào)可以帶來一些意想不到的效果,。能展望的,，也只有裂解液了。現(xiàn)在的裂解液,，都沒有同步去除蛋白質(zhì)的功能,；蛋白質(zhì)的去除，或者靠裂解后再加入苯酚抽提去除蛋白質(zhì),，或者靠加入高鹽溶液去除蛋白質(zhì),，效果也不錯(cuò)。能做的改進(jìn),，看起來也就只有配制出這樣一種裂解液：裂解效率高 (得率的保證),，同時(shí)蛋白質(zhì)可以靠離心去除(操作簡(jiǎn)化了),。簡(jiǎn)單地講，下面提供的是目前可以想象的結(jié)合有高得率,、高純度,、操作zui簡(jiǎn)單諸多特點(diǎn)的操作步驟 (以細(xì)胞為例。組織搗碎后也適用)： 在樣品中加入裂解液,，混勻后,，靜置使裂解*。高速離心后,，蛋白質(zhì)沉淀在離心管的底部，上清則為核酸,。將上清轉(zhuǎn)移到預(yù) 先已經(jīng)加入了醇的離心管中,，輕輕混勻后，用一個(gè)小鉤撈出大的絮狀沉淀 (以DNA 為主) 到另外一個(gè)離心管中,；撈不起來的 (主要是 RNA) 用離心沉底,。分別洗滌蛋白質(zhì)沉淀，DNA絮狀沉淀和 RNA 離心的沉淀,，再分別溶解,，就可以同步獲得 DNA/RNA/蛋白質(zhì)了。
h：醇沉淀的語言 Flash – 從低濃度核酸沉淀?xiàng)l件的改變看核酸是如何形成沉淀的 核酸醇沉淀的原理,，按照分子克隆中的描述,，是用陽離子中和了磷酸根的負(fù)電荷后，核酸"無性"結(jié)合才能沉淀下來,。低濃度核酸沉淀的條件一般要做如下改變：使用長(zhǎng)時(shí)間的低溫,、使用更高比例的醇、使用 tRNA 之類的東西,。下面就用 Flash 語言的特點(diǎn),，描述一下"無性"的核酸是如何結(jié)合的。 溶液中的單個(gè)核酸,，雖然是"無性"的,，對(duì)其它的核酸，仍然是有引力的(大小與距離相關(guān)),；同時(shí),，核酸分子受到的另外一個(gè)力，來自分子運(yùn)動(dòng),。在一般情況下,，核酸之間的引力比分子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的力小許多；只有當(dāng)核酸之間的距離足夠近時(shí),，引力才能克服分子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的力,，使兩個(gè)核酸結(jié)合到一起,。結(jié)合在一起的兩個(gè)核酸又共同對(duì)其它的核酸產(chǎn)生引力(該引力比單個(gè)核酸的要大)，結(jié)合上更多的核酸 … zui終沉淀下來了,。低溫和更高濃度的醇都有利于降低分子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的力,，tRNA能提高總核酸濃度進(jìn)而通過與目的核酸的結(jié)合提高了目的核酸之間的引力，所以低濃度核酸的沉淀?xiàng)l件如上,。至于 2價(jià)鎂離子有利于低濃度核酸的沉淀原因,，可能是鎂離子要被同一核酸分子的兩個(gè)磷酸根結(jié)合，這種結(jié)合的結(jié)果是核酸分子變得更立體了（團(tuán)狀）：引力越集中,，對(duì)外就越大,。elisa試劑盒
i：從柱離心式產(chǎn)品的流行看經(jīng)典方法的缺點(diǎn) （或者操作重點(diǎn)） 柱式方法的風(fēng)行是無法否定的現(xiàn)實(shí)。下面通過柱式方法與經(jīng)典方法的比較,，看一看如何注意經(jīng)典方法的操作重點(diǎn),。 裂解，二者幾乎沒有任何區(qū)別,。去蛋白質(zhì),，柱式靠的是柱材料對(duì)蛋白質(zhì)吸附力低這一特點(diǎn)，將蛋白質(zhì)殘留控制在比較低的水平(并不是/也不能*去除),；經(jīng)典方法zui常用的是 PC 抽提,，可以將蛋白質(zhì)去除得更*一些。其它大分子雜質(zhì) - 如多糖等 -的去除,，柱式的與蛋白質(zhì)的去除相似,，但經(jīng)典方法中卻沒有如此方便的對(duì)應(yīng)方法。小分子物 (鹽等)的去除,，在我的眼里,，是柱式方法zui可愛的地方。如果柱子設(shè)計(jì)沒有問題,，離心后柱子中殘留的液體穩(wěn)定而少,；柱式的洗滌具有"流水洗滌"的效果；柱式中的核酸是不成團(tuán)塊的 - 這三個(gè)特點(diǎn)決定了柱式的洗滌效率比經(jīng)典的洗滌效率高,，所以,，柱式純化的核酸純度比較高。 結(jié)論是：裂解和去蛋白質(zhì)的能力,，經(jīng)典方法不次于柱式方法,；去除其它大分子雜質(zhì)，經(jīng)典方法不如柱式,；洗滌能力,，按目前各種參考書中的介紹去做，幾乎沒有辦法超過柱式方法。你看一看上面柱式方法洗滌的特點(diǎn),，經(jīng)典洗滌方法哪一條強(qiáng)調(diào)了,。再想一想你是如何手工洗衣服的，象不象柱式洗滌的特點(diǎn),，就應(yīng)該不會(huì)有疑問的吧,。難道過去的核酸沉淀洗滌方法有錯(cuò)誤？那倒不是,。真正的原因是,，過去核酸抽提使用的小分子物(鹽等)，多是后續(xù)酶反應(yīng)中會(huì)使用到的或者起碼少量的殘留不會(huì)抑制后續(xù)酶反應(yīng)的,；現(xiàn)在抽提中使用的東西就不一樣了,，都是一些對(duì)蛋白質(zhì)有強(qiáng)烈作用的東西，而且濃度還非常高,。過去有資料強(qiáng)調(diào)測(cè) A230 值嗎,？自打 Guanidine Thiocyanate 開始廣泛用于核酸抽提后，A260/A230比值的測(cè)定成為檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)非常重要的指標(biāo)了,。 如果將洗滌操作更強(qiáng)化及嚴(yán)格一點(diǎn)，對(duì)于一般比較干凈的樣品,，你會(huì)發(fā)現(xiàn)經(jīng)典方法抽提的核酸*可以達(dá)到非常好的質(zhì)量的,。柱式就還留下一個(gè)"快"的特點(diǎn)，當(dāng)然應(yīng)該說是"更快",。 有一個(gè)無心插柳的結(jié)果供分享：加入醇沉淀基因組 DNA時(shí),，將沉淀挑到另外一個(gè)離心管中，挑不起來的離心使之沉淀,；同樣洗滌/干燥/溶解后,，同時(shí)電泳。電泳顯示：離心沉淀的加樣孔幾乎無熒光,，20kb左右有一條亮帶,；挑出來的加樣孔熒光非常強(qiáng)烈，從加樣孔到 20kb 之間有彌散帶,，但沒有清晰的主帶,。elisa試劑盒