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維持ES細胞處于未分化狀態(tài)：

ES細胞培養(yǎng)用含有ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化,。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì),。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次,，細胞傳代以后,，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預(yù)先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時,，使分化細胞粘附,，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃,，5％CO2,，100％濕度條件下培養(yǎng),。elisa試劑盒

培養(yǎng)基：ES：配制一20×不含DMEM，HS,，ESGRO的溶液(該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文),。分裝在50ml FALCON管中，(稀釋為2×,，每管42ml),，貯存在-20℃。通過將21ml該溶液,，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基,，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃,。 
注：一瓶DMEM是500ml,。

貯存液：DMEM(高糖)、馬血清(HS),、L-谷氨酰胺(200mM),、MEM NEAA(10mM)、HEPES(1M),、β-巰基乙醇(55Mm),、PEST、ESGRO,。

復(fù)蘇細胞：細胞被凍存在10％二甲基亞砜(DMSO)中防止結(jié)晶的形成,，結(jié)晶的形成會損害細胞。然而,，二甲基亞砜對細胞有毒性,，快速的進行細胞復(fù)蘇是很重要的。

操作步驟：
1．從液氮中取出一管細胞,；
2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘(或放到管內(nèi)溶液恰好*溶解),；
3．將細胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培養(yǎng)基(用培養(yǎng)基沖洗凍存管),；
5．離心3分鐘；
6．棄上清,，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞,，至少吹打10次；
7．接種在明膠包被(見下文)的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿,；
8．孵育,。

凍存細胞elisa試劑盒

凍存液：90％HS和10％二甲基亞砜

步驟：
1．1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；
2．用細胞刮刀收集細胞,；
3．將細胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘,；
4．棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中(10cm的培養(yǎng)皿用2ml,，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml。)
5．分裝于凍存管內(nèi),，每管1ml,；
6．置－80℃，第二天移入液氮,。

明膠包被：準備500ml 0.1％明膠溶液
1．將0.5g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中(50－65℃水浴15～30分鐘),。
2．在溶液沒有冷卻的情況下通過0.2μm濾膜過濾，貯存在4℃,。
包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
1．加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面(15cm培養(yǎng)皿加2ml,，10cm培養(yǎng)皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要,，只要能*覆蓋培養(yǎng)表面就行了,。)；
2．置室溫30分鐘,；
3．去除明膠溶液,，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，將板子平方,，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板,。elisa試劑盒