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技術(shù)文章

人亞油酸ELISA檢測試劑盒的實驗分析

閱讀:260          發(fā)布時間:2014-7-23

人亞油酸ELISA檢測試劑盒

    LA試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知LA濃度的標準品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測,。先將LA和生物素標記的抗體同時溫育,。洗滌后,,加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,,然后加入底物A、B,,和酶結(jié)合物同時作用,。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中LA的濃度呈比例關(guān)系,。

操作注意事項
試劑應(yīng)按標簽說明書儲存,,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄,,不可保存,。
實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,,以免變質(zhì),。
不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用,。
使用一次性的吸頭以免交叉污染,,吸取終止液和底物A、B液時,,避免使用帶金屬部分的加樣器,。
使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。
洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干,,不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。
底物A應(yīng)揮發(fā),,避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下,。避免用手接觸,,有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值,。
加入試劑的順序應(yīng)一致,,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
按照說明書中標明的時間,、加液的量及順序進行溫育操作,。

樣品收集、處理及保存方法

血清-----操作過程中避免任何細胞刺激,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離,。
血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測,。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。
細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎,。1000×g離心10分鐘,,取上清液
保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,,避免反復(fù)冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
標準品:標準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備,,不能儲存,。稀釋前將標準品振蕩混勻。

洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋,。

操作步驟
使用前,,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,,以免加樣時加入大量的氣泡,,產(chǎn)生加樣上的誤差,。
根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。標本用標本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔,、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,,輕輕振蕩混勻,,37℃溫育1小時。
甩去孔內(nèi)液體,,每孔加滿洗滌液,,振蕩30秒,甩去洗滌液,,用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,,洗滌次數(shù)增加一次,。
每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,,37℃溫育30分鐘,。
甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,,振蕩30秒,,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次,。如果用洗板機洗滌,,洗滌次數(shù)增加一次。
每孔加入底物A,、B各50ul,,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘,。避免光照,。
取出酶標板,迅速加入50ul終止液,,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果,。
在450nm波長處測定各孔的OD值。

局限
6號標準品以上的結(jié)果為非線性的,,根據(jù)此標準曲線無法得到的結(jié)果,。

試劑盒性能
1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990,。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性:板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于10%,。

結(jié) 果 判 斷 與 分 析
1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2,、以吸光度OD值為縱坐標(Y),,相應(yīng)的LA標準品濃度為橫坐標(X),做得相應(yīng)的曲線,,樣品的LA含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度,。

3、檢測值范圍:0-800mg/L

4,、敏感度: 1.0 mg/L

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