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撫生試劑-ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素-4
閱讀:174 發(fā)布時(shí)間:2014-6-6ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素-4
白細(xì)胞介素-4(1L-4)是Th2細(xì)胞分泌的一類重要細(xì)胞因子,,可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的黏附,介導(dǎo)IgE的產(chǎn)生,,在局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)中發(fā)揮作用,,同時(shí)IL-4可使IgE受體表達(dá)增強(qiáng),誘導(dǎo)嗜酸細(xì)胞聚集和遷移,。
[檢測(cè)方法] ELISA法
[方法學(xué)原理] 在微孔反應(yīng)板上包被抗人IL-4單克隆抗體,,待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-4會(huì)與抗人IL-4單克隆抗體結(jié)合,游離的成分被洗去,,同時(shí)加入生物素化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素,。生物素與親和素特異結(jié)合,抗人IL-4抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人IL-4結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,,游離的成分被洗去,。加入顯色劑,若反應(yīng)孑L中有IL-4,,HRP會(huì)使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色,,加終止液變黃色。在波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光度,,IL-4濃度與吸光度成正比,,可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的IL-4濃度。
[標(biāo)本準(zhǔn)備] 靜脈血2ml,,不抗凝,。
[試劑]
1.預(yù)包被微孔反應(yīng)板
2.濃縮酶結(jié)合物
3.酶結(jié)合物稀釋液
4.標(biāo)準(zhǔn)晶和標(biāo)本稀釋液
5.濃縮生物素化抗體
6.IL-4標(biāo)準(zhǔn)品
7.濃縮洗滌液
8.顯色劑A、B
9.終止液
[儀器] 酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,。
[檢測(cè)步驟]
1.在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測(cè)樣本,、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul,再加生物素化抗體.工作液50ul,。
2.振蕩混勻,,置20~25℃環(huán)境中溫育120min,。
3.將孔內(nèi)液體吸干,用洗滌液充分洗滌5次,,干燥,。
4.除空白孔外,加入酶結(jié)合物工作液100ul,。
5.振蕩混勻,,置20~25℃環(huán)境中溫育30min。
6.將孔內(nèi)液體吸干,,用洗滌液充分洗滌5次,,干燥。
7.每孔加入顯色劑A,、B各50fA,,輕輕振蕩混勻,37℃環(huán)境中避光顯色10min,。
8.加入終止液50tA后,,輕輕振蕩混勻。用酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng))測(cè)定各孔吸光度,,與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照,,求出IL-4水平。
[正常參考值] 務(wù)實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢測(cè)方法的不同確立正常參考值范圍,。
[注意事項(xiàng)]
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用,,未用完的微孔條用自封袋密封保存。
2.酶標(biāo)板洗滌時(shí)各孔均需加滿洗滌液,,防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈,。應(yīng)設(shè)定30—60s的洗滌浸泡時(shí)間。
3.滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次,,使液體混勻,。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直,以使滴量準(zhǔn)確(注意:勿將試劑滴在孔壁上),。
4.所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol/L硫酸,,使用時(shí)應(yīng)注意安全,。
5.每批樣本應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.若標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍以外,,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè),。