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技術(shù)文章

撫生試劑-ELISA法檢測白細胞介素-4

閱讀:195          發(fā)布時間:2014-6-6

ELISA法檢測白細胞介素-4
 
    白細胞介素-4(1L-4)是Th2細胞分泌的一類重要細胞因子,可促進巨噬細胞的黏附,,介導(dǎo)IgE的產(chǎn)生,,在局部炎性細胞浸潤中發(fā)揮作用,同時IL-4可使IgE受體表達增強,,誘導(dǎo)嗜酸細胞聚集和遷移,。
    [檢測方法]  ELISA法
    [方法學(xué)原理]  在微孔反應(yīng)板上包被抗人IL-4單克隆抗體,待測標本和標準品中的IL-4會與抗人IL-4單克隆抗體結(jié)合,,游離的成分被洗去,,同時加入生物素化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。生物素與親和素特異結(jié)合,,抗人IL-4抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人IL-4結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,,游離的成分被洗去。加入顯色劑,,若反應(yīng)孑L中有IL-4,,HRP會使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍色,加終止液變黃色,。在波長450nm處測吸光度,,IL-4濃度與吸光度成正比,可通過繪制標準曲線求出標本中的IL-4濃度,。
    [標本準備]  靜脈血2ml,,不抗凝。
    [試劑]
    1.預(yù)包被微孔反應(yīng)板
    2.濃縮酶結(jié)合物
    3.酶結(jié)合物稀釋液
    4.標準晶和標本稀釋液
    5.濃縮生物素化抗體
    6.IL-4標準品
    7.濃縮洗滌液
    8.顯色劑A,、B
    9.終止液
    [儀器]  酶標儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀,。   
    [檢測步驟]
    1.在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測樣本、不同濃度標準品100ul,,再加生物素化抗體.工作液50ul,。
    2.振蕩混勻,,置20~25℃環(huán)境中溫育120min。
    3.將孔內(nèi)液體吸干,,用洗滌液充分洗滌5次,,干燥。
    4.除空白孔外,,加入酶結(jié)合物工作液100ul,。
    5.振蕩混勻,置20~25℃環(huán)境中溫育30min,。
    6.將孔內(nèi)液體吸干,,用洗滌液充分洗滌5次,干燥,。
    7.每孔加入顯色劑A,、B各50fA,輕輕振蕩混勻,,37℃環(huán)境中避光顯色10min,。
    8.加入終止液50tA后,輕輕振蕩混勻,。用酶標儀(450nm波長)測定各孔吸光度,,與標準曲線對照,求出IL-4水平,。
    [正常參考值]  務(wù)實驗室可根據(jù)檢測方法的不同確立正常參考值范圍,。
    [注意事項]
    1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用,未用完的微孔條用自封袋密封保存,。
    2.酶標板洗滌時各孔均需加滿洗滌液,,防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應(yīng)設(shè)定30—60s的洗滌浸泡時間,。
    3.滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次,,使液體混勻。滴加時瓶身應(yīng)保持垂直,,以使滴量準確(注意:勿將試劑滴在孔壁上),。
    4.所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol/L硫酸,,使用時應(yīng)注意安全,。
    5.每批樣本應(yīng)同時做標準曲線。
    6.若標本OD值在標準曲線測定范圍以外,,應(yīng)適當稀釋后重測,。
 

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