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撫生試劑-酵母菌免疫染色的操作步驟
閱讀：173 發(fā)布時間：2014-5-29酵母菌免疫染色的操作步驟
(1)在細胞染色之前，制備溶于蒸餾水的lmg／m1多聚賴氨酸溶液(平均分子質(zhì)量400kDa),。將多聚賴氨酸涂于載玻片上,，孵育15min。用水沖洗玻片,，干燥后將玻片保存在室溫,。
(2)建立對數(shù)生長期的酵母菌細胞。取出生長培養(yǎng)的樣品,。
(3)加入5倍體積的新鮮配制的4％多聚甲醛(見附錄Ⅳ,，但不溶于PBS中而用0．1mol／L磷酸鉀溶解，pH6．5),。
(4)混均后于室溫下孵育90min,。
(5)用0．1mol／L磷酸鉀(pH6．5)洗細胞3次。
(6)zui后將沉淀重懸于1．2m01／L,、0．12mol／L磷酸鉀和33mm01／L檸檬酸(pH5．9)中,。
(7)加1／10體積p—葡萄糖醛酸酶(原液來自Helix pomatia，終濃度約為10 000U／m1)和1／100體積的酵母菌裂解酶(或溶細胞酶,，終濃度為50U／m1),，以消化細胞壁。于30℃下孵育90min,。
葡萄糖醛酸酶去除細胞壁的時間長短依賴于該酶的不同批號,，在某些情況下也依賴于不同的染色方法或酵母菌的種類。
(8)用山梨醇緩沖液洗細胞3次,。
(9)將細胞懸液加到涂有多聚賴氨酸的載玻片或蓋玻片上,，于室溫下孵育15min。
(10)將玻片浸入甲醇中,， —20℃6min,。
(11)將玻片轉(zhuǎn)置丙酮中， —20℃30s,。
(12)在含1％BSA的PBS中漂洗玻片5min,。
(13)在含1％羊IgG的PBS中孵育玻片1h。
在此方法中,，來自非免疫動物的羊IgG用作封閉劑,。可以從正常羊血清中通過蛋白G純化而獲得,。該封閉試劑是有選擇的,，因本文推薦的標記二級試劑是羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白抗體,。如果使用的是其他來源的標記二級試劑，應改變封閉劑,，如可選用3％牛血清白蛋白,。
(14)用PBS洗玻片一次。
(15)將蓋玻片,、載玻片或平皿放置在乎面上,。
(16)加足量的一抗覆蓋所需的面積。通常體積
單克隆抗體通常從雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中獲得(特異性抗體濃度為20—50vg／m1),。小鼠腹水,、純化的單克隆和多克隆抗體以及粗制的多克隆抗血清應該測試其稀釋度。如果特異性抗體的濃度是未知的,，制備并測試初始制品的不同稀釋度(1：10，1：100,，1：1 000,，1：10 000)。
(17)將蓋玻片,、載玻片或平皿在室溫下至少孵育30min,。若孵育的時間<1h，則不需要保持濕度,，可將玻片放置在桌面上,。對于某些抗原抗體反應，孵育時間延長達12h可增加反應的靈敏度,。但一定不能讓樣品干燥,，簡單的辦法是放一片封口膜在樣品上。較長時間的反應應降低*抗體的濃度,。
(18)用PBS洗3次,，每次5min以上。
PBS緩沖液中可以含1％TritonX-100或NP-40,，以幫助解決背景問題,。
(19)加入熒光素標記的抗Ig抗體。這些試劑可從商品試劑公司購置,。應確認所選擇的第二抗體對于一抗是特異性的,。例如，如果*抗體是由兔所產(chǎn)生的,，則應選擇羊抗兔Ig,。第二抗體應該用含蛋白質(zhì)的溶液如1％羊IgG進行稀釋。試劑提供者可建議適合的稀釋度,，但如果沒有提供有關信息,，可進行二抗稀釋度測定，稀釋度范圍在1：10和1：1000之間。
(20)加入標記的二抗試劑后在室溫下孵育至少20rain,，但不應超過1h,。
(21)用PBS洗3次，每次5min以上,。
(22)用Gelvatol或Mowiol封片,。在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察并照相。