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撫生試劑-酵母菌免疫染色的操作步驟
閱讀：174 發(fā)布時(shí)間：2014-5-29酵母菌免疫染色的操作步驟
(1)在細(xì)胞染色之前,，制備溶于蒸餾水的lmg／m1多聚賴氨酸溶液(平均分子質(zhì)量400kDa),。將多聚賴氨酸涂于載玻片上，孵育15min,。用水沖洗玻片,，干燥后將玻片保存在室溫。
(2)建立對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母菌細(xì)胞,。取出生長(zhǎng)培養(yǎng)的樣品,。
(3)加入5倍體積的新鮮配制的4％多聚甲醛(見附錄Ⅳ，但不溶于PBS中而用0．1mol／L磷酸鉀溶解,，pH6．5),。
(4)混均后于室溫下孵育90min。
(5)用0．1mol／L磷酸鉀(pH6．5)洗細(xì)胞3次,。
(6)zui后將沉淀重懸于1．2m01／L,、0．12mol／L磷酸鉀和33mm01／L檸檬酸(pH5．9)中。
(7)加1／10體積p—葡萄糖醛酸酶(原液來自Helix pomatia,，終濃度約為10 000U／m1)和1／100體積的酵母菌裂解酶(或溶細(xì)胞酶,，終濃度為50U／m1)，以消化細(xì)胞壁,。于30℃下孵育90min,。
葡萄糖醛酸酶去除細(xì)胞壁的時(shí)間長(zhǎng)短依賴于該酶的不同批號(hào),，在某些情況下也依賴于不同的染色方法或酵母菌的種類。
(8)用山梨醇緩沖液洗細(xì)胞3次,。
(9)將細(xì)胞懸液加到涂有多聚賴氨酸的載玻片或蓋玻片上,，于室溫下孵育15min。
(10)將玻片浸入甲醇中,， —20℃6min,。
(11)將玻片轉(zhuǎn)置丙酮中， —20℃30s,。
(12)在含1％BSA的PBS中漂洗玻片5min,。
(13)在含1％羊IgG的PBS中孵育玻片1h。
在此方法中,，來自非免疫動(dòng)物的羊IgG用作封閉劑,。可以從正常羊血清中通過蛋白G純化而獲得,。該封閉試劑是有選擇的,，因本文推薦的標(biāo)記二級(jí)試劑是羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白抗體。如果使用的是其他來源的標(biāo)記二級(jí)試劑,，應(yīng)改變封閉劑,，如可選用3％牛血清白蛋白。
(14)用PBS洗玻片一次,。
(15)將蓋玻片,、載玻片或平皿放置在乎面上。
(16)加足量的一抗覆蓋所需的面積,。通常體積
單克隆抗體通常從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中獲得(特異性抗體濃度為20—50vg／m1),。小鼠腹水、純化的單克隆和多克隆抗體以及粗制的多克隆抗血清應(yīng)該測(cè)試其稀釋度,。如果特異性抗體的濃度是未知的,，制備并測(cè)試初始制品的不同稀釋度(1：10，1：100,，1：1 000,，1：10 000)。
(17)將蓋玻片,、載玻片或平皿在室溫下至少孵育30min,。若孵育的時(shí)間<1h，則不需要保持濕度,，可將玻片放置在桌面上,。對(duì)于某些抗原抗體反應(yīng)，孵育時(shí)間延長(zhǎng)達(dá)12h可增加反應(yīng)的靈敏度,。但一定不能讓樣品干燥,，簡(jiǎn)單的辦法是放一片封口膜在樣品上,。較長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)應(yīng)降低*抗體的濃度。
(18)用PBS洗3次,，每次5min以上,。
PBS緩沖液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以幫助解決背景問題,。
(19)加入熒光素標(biāo)記的抗Ig抗體,。這些試劑可從商品試劑公司購(gòu)置。應(yīng)確認(rèn)所選擇的第二抗體對(duì)于一抗是特異性的,。例如,，如果*抗體是由兔所產(chǎn)生的，則應(yīng)選擇羊抗兔Ig,。第二抗體應(yīng)該用含蛋白質(zhì)的溶液如1％羊IgG進(jìn)行稀釋,。試劑提供者可建議適合的稀釋度，但如果沒有提供有關(guān)信息,，可進(jìn)行二抗稀釋度測(cè)定,，稀釋度范圍在1：10和1：1000之間。
(20)加入標(biāo)記的二抗試劑后在室溫下孵育至少20rain,，但不應(yīng)超過1h,。
(21)用PBS洗3次，每次5min以上,。
(22)用Gelvatol或Mowiol封片,。在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察并照相。