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ELISA試劑組成
 
    1．抗原  在ELISA中應(yīng)用的抗原要求有較高的特異性,、親和力和純度,。主要有3類,，即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原,。自然抗原的純度不高,，特異性不強；合成抗原一般為多肽片段,，缺乏天然抗原所具有的立體結(jié)構(gòu)表位,，親和力不高，可能導(dǎo)致相應(yīng)表位的抗體漏檢,；基因重組抗原具有安全,、特異性強、親和力高,、產(chǎn)量大等特點,，是一種比較理想的抗原，但其純化比較困難,。
 
    2．抗體  在ELISA中應(yīng)用的抗體可分為多克隆抗體(多抗)和單克隆抗體(單抗),。多抗取白免疫動物的抗血清，制備較簡單,，但抗血清成分復(fù)雜,，除含針對抗原(多個表位)的抗體外，還含有多種其他抗體,，親和力和特異性相對要低于單抗,，且制備周期長，批間差異較大,。而單抗僅針對抗體的單一表位,，親和力和特異性均較多抗高，且制備技術(shù)成熟,，產(chǎn)量大，批間差異小,，但結(jié)合位點的單一也正是其弱點之所在,，在雙抗體夾心法中，如包被和指示抗體使用同一單抗,，則由于結(jié)合位點的缺乏,，容易造成假陰．性結(jié)果。在使用雙單抗一步法時,，應(yīng)注意抗原過剩時的“鉤狀效應(yīng)”
 
    3．酶和底物  在ELISA中zui常用的酶為HRP和ALP,。
    (1)HRP：是一種糖蛋白，含糖量約18％，分子量為44kD,，在蔬菜作物辣根中含量很高,。HRP是一種復(fù)合酶，由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)結(jié)合形成一種卟啉蛋白質(zhì),。主酶為五色糖蛋白,，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),，是酶的活性基團,，在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用純度值(reinhartzahl,，RZ)表示,，RZ＝A403nm／A275nm，即403nm的吸光度與280nm的吸光度之比,，高純度HRP的RZ值應(yīng)≥3．0,。HRP質(zhì)量的另一重要指標是酶活力，以單位(unit,，U)表示,。用于標記的HRP比活性應(yīng)≥250U／mg。HRP的作用底物為H202,，催化下列反應(yīng),；
DH2+H202  HRP  D+2H2O
   上式中DH2為供氫體(即底物)，H2O2為受氫體,。HRP對受氫體的專一性很高,，除H2O2外，僅作用于小分子醇和尿素的過氧化物,。HRP的底物有多種,，在ELISA中常用的有：鄰苯二胺(orthophenylenediamine，OPD),，四甲基聯(lián)苯胺(3,，3，5,，5-tetramethyl-benzidine,，TMB)和2，2,，-連氮基-雙-3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽[2,，2，-azino-bisc(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6),，ABTS],。三者各有優(yōu)缺點：OPD是在ELISA中應(yīng)用zui多的底物,，靈敏度高，比色方便,，但配成溶液后穩(wěn)定性差,，且有致異變性；TMB經(jīng)酶作用后由五色變藍色,，加酸終止反應(yīng)后顯黃色,，目測對比鮮明，可比色定量,，溶液的穩(wěn)定性也較差,，但無致異變性，因此應(yīng)用日見增多,；ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB,，但空白值很低。
    (2)ALP：是一種磷酸酯的水解酶,，用做示蹤酶的ALP活性應(yīng)在l 000U／mg以上,。ALP常用的底物為對硝基苯磷酸鹽(PNP)，降解產(chǎn)物為黃色的對硝基酚,。經(jīng)NaOH終止酶反應(yīng)后,，顏色維持比較穩(wěn)定。
在ELISA中酶作用于底物后生成有色物質(zhì),、熒光物質(zhì)或?qū)е禄瘜W發(fā)光,，分別可用分光光度計、熒光光度計測量及照度計測量,。熒光和化學發(fā)光測定的敏感度均高于比色測定,，標準曲線的線性范圍亦較比色反應(yīng)寬，測定效果優(yōu)于常用的比色ELISA,。
 
    4．固相載體  固相載體是ELISA中用以分離結(jié)合標記物和游離標記物的主要手段,，應(yīng)與各種免疫活性物質(zhì)有良好的結(jié)合性能并且不改變其免疫活性。常用的固相載體有聚苯乙烯塑料和硝酸纖維素膜,。
 
    5．包被  將免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)結(jié)合于固相載體上的過程稱為包被,。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纖維薄膜等,；常用的方法有吸附法,、化學交聯(lián)法及親和素-生物素間接包被法，特別是后一方法,，效率高，而且可用以包被不易吸附在固相上的各種免疫活性物質(zhì),。具體做法是先將鏈霉親和素包被在固相載體上,，然后使與生物素化的抗原或抗體與之結(jié)合,。由于親和素與生物素之間的高親和力，抗原或抗體即間接結(jié)合在親和素包被的固相上,。
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