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撫生試劑-單克隆抗體技術(shù)概念,、原理,、基本方法和操作流程
閱讀：171 發(fā)布時(shí)間：2014-5-22骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
選擇瘤細(xì)胞株的zui重要的一點(diǎn)是與待融合的B細(xì)胞同源。如待融合的是脾細(xì)胞,，各種骨髓瘤細(xì)胞株均可應(yīng)用,，但應(yīng)用zui多的是Sp2/0細(xì)胞株。該細(xì)胞株生長(zhǎng)及融合效率均佳,，此外,，該細(xì)胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細(xì)胞的zui高生長(zhǎng)刻度為9×105/ml,，倍增時(shí)間通常為10～15h,。融合細(xì)胞應(yīng)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞（活性應(yīng)大于95％）,。骨髓瘤細(xì)胞株在融合前應(yīng)先用含8-氮鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng),，在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為2105/ml，次日一般即為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,。
在體外培養(yǎng)條件下,，細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴(lài)適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而,，在培養(yǎng)融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時(shí),，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercell）,。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔,，輕揉腹部數(shù)次,，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細(xì)胞，其中在巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞,。亦有用小鼠的脾細(xì)胞,、大鼠或豚鼠的腹腔細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的。
在制備飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí),，切忌針頭刺破動(dòng)物的消化器官,，否則所獲細(xì)胞會(huì)有嚴(yán)重污染。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至1×105/ml,，提前一天或當(dāng)天置板孔中培養(yǎng),。
細(xì)胞融合
細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合,。其后吧培養(yǎng)液稀釋PEG,，消除PEG的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋?zhuān)种门囵B(yǎng)板孔中培養(yǎng),。融合過(guò)程中有幾個(gè)問(wèn)題應(yīng)特別注意,。①細(xì)胞比例：骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從1:2到1:10不等，常用1:4的比例,。應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性,。②反應(yīng)時(shí)間：在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第1min滴加4.5ml培養(yǎng)液,；間隔2min滴加5ml培養(yǎng)液,，爾后加培養(yǎng)液50ml。③培養(yǎng)液的成分：對(duì)融合細(xì)胞,，良好的培養(yǎng)液尤其重要,，其中的小牛血清、各種離子和營(yíng)養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制,。如融合效率降低,，應(yīng)隨時(shí)核查培養(yǎng)基情況。
有限稀釋法
篩選陽(yáng)性株一般選用的骨髓瘤細(xì)胞為HAT敏感細(xì)胞株,，所以只有融合的細(xì)胞才能待續(xù)存活一周以上,。融合細(xì)胞呈克隆生長(zhǎng)，經(jīng)有限稀釋后（一般稀釋至0.8個(gè)細(xì)胞/ 孔）,，按Poisson法計(jì)算，應(yīng)有36％的孔為1個(gè)細(xì)胞/孔,。細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋0％～20％孔底時(shí),，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)抗體含量,。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化,，爾后進(jìn)行抗原特異的ELISA測(cè)定,，選高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。
單克隆抗體的制備和凍存
篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備,，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加,?？贵w制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法,，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng),，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備,，一般應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基,，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。zui普遍采用的是小鼠腹腔接種法,。選用BALB/c 小鼠或其親代小鼠,，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去,。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生,，每只小鼠可收集 5～10ml的腹水，有時(shí)甚至超過(guò)40ml,。該法制備的腹水抗體含量高,，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外,，腹水中的雜蛋白也較少,，便于抗體的純化。接種細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)適當(dāng),，一般為5×105/鼠,，可根據(jù)腹水生長(zhǎng)情況適當(dāng)增減。
選出的陽(yáng)性細(xì)胞株應(yīng)及早凍存,。凍存的溫度越低越好,，凍存于液氮的細(xì)胞株活性?xún)H有輕微的降低，而凍存在－70℃冰箱則活性改變較快,。細(xì)胞不同于菌種,，凍存過(guò)程中需格外小心。二甲亞砜（DMSO）是普遍應(yīng)用的凍存保護(hù)劑,。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活性多在50％～95％之間,。如果低于50％,，則說(shuō)明凍存復(fù)蘇過(guò)程有問(wèn)題。
單克隆抗體的純化
單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化,，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高,，純化效果好。按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法,。一般采用鹽析,、凝膠過(guò)濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的，也有采用較簡(jiǎn)單的酸沉淀方法,。目前zui有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法,，多用葡萄球菌A 蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體（zui常用Sepharose）交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫,，回收率可達(dá)90％以上,。蛋白可與IgG1、 IgG2a,、IgG2b和IgG3結(jié)合,，同時(shí)還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測(cè),，小鼠IgG單克隆抗體溶液在A280nm 時(shí),，1.44（吸光單位）相當(dāng)于1mg/ml。經(jīng)低pH洗脫后在收集管內(nèi)預(yù)置中和液或速加中和液對(duì)保持純化抗體的活性至關(guān)重要,。