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撫生試劑-ELISA [酶聯(lián)免疫吸附試驗]原理與分類
閱讀：140 發(fā)布時間：2014-4-22ELISA [酶聯(lián)免疫吸附試驗]原理與分類
【摘要】：1. ELISA 的原理 ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記,。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,，又保留酶的活性,。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開,。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗
相關(guān)專題 ELISA免疫實驗技術(shù) 1. elisa 的原理
ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,，又保留酶的活性。在測定時,，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上,。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。
2. ELISA 的類型
ELISA 可用于測定抗原,，也可用于測定抗體,。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑 "（immunosorbent）,；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體,，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；
（3）酶反應(yīng)的底物,。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件,，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的ELISA 主要有以下幾種類型：
2.2.1 雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,，操作步驟如下：
1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),。
2）加受檢標(biāo)本,，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3） 加酶標(biāo)抗體,，保溫反應(yīng),。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
4）加底物顯色,。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。通過比色，測知標(biāo)本中抗原的量,。在臨床檢驗中,，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg ,、HBeAg,、AFP 、hCG 等,。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,，包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動物,。如應(yīng)用單克隆抗體,，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物,。這種雙位點夾心法具有很高的特異性,，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測,。
在一步法測定中,，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,，而不再形成 "夾心復(fù)合物",。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同,，如按常法測讀,，所得結(jié)果將低于實際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect）,，因為標(biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落,。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg ,、AFP 和尿液hCG 等）時，應(yīng)注意可測范圍的zui高值,。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng),。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如 HBsAg 的a 決定簇,，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物,。但在HBsAg 的檢測中應(yīng)注意亞型問題，HBs Ag 有adr,、adw,、ayr 、ayw4 個亞型,，雖然每種亞型均有相同的a 決定簇的反應(yīng)性,，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風(fēng)濕因子（ RF）的干擾,。RF 是一種自身抗體,，多為IgM 型，能和多種動物IgG 的Fc 段結(jié)合,。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有R F,，它可充當(dāng)抗原成份，同時與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng),。采用F（ab’）或Fab 片段作酶結(jié)合物的試劑,，由于去除了Fc 段，從而消除RF 的干擾,。雙抗體夾心法ELISA 試劑是否受RF 的影響,，已被列為這類試劑的一項考核指標(biāo)。
雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,，因其不能形成兩位點夾心。
2.2.2 雙抗原夾心法測抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似,。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體,。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法,。乙肝標(biāo)志物中抗 HBs 的檢測常采用本法,。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,，尋找合適的標(biāo)記方法,。