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撫生試劑-做好免疫組化染色必須注意的問題
閱讀：102 發(fā)布時(shí)間：2014-4-16做好免疫組化染色必須注意的問題
一,、為達(dá)到免疫組織化學(xué)技術(shù)的要求,，組織固定越新鮮越好。
在免疫組化zui后結(jié)果的判斷時(shí),，?？梢姷骄鶆蛞黄乃品翘禺愋匀旧默F(xiàn)象，經(jīng)多方研究認(rèn)為,，它是一種假性非特異性的染色,。因?yàn)槟[瘤組織中含有的抗原較易發(fā)生擴(kuò)散彌散，腫瘤細(xì)胞無限制的生長和生長過速,，導(dǎo)致腫瘤中間部分組織血液供給困難,，造成缺血壞死，壞死細(xì)胞中的抗原由于機(jī)體的作用,，可以被均勻地散布于細(xì)胞與細(xì)胞間的間質(zhì),，這是抗原發(fā)生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是,，由于組織沒有及時(shí)的固定所引起的,。離體的組織不及時(shí)固定，組織就會(huì)自溶,，抗原就會(huì)擴(kuò)散,，這是一非常普通的常識(shí)，但要做好卻是極不容易,。標(biāo)本從外科切除到浸入固定液需要經(jīng)過一段時(shí)間,，在這段時(shí)間里，有的抗原就可以發(fā)生擴(kuò)散,。雖然已浸入了固定液,，但標(biāo)本較大，固定液的量又不足,，當(dāng)然由于固定液的滲透需要時(shí)間,，當(dāng)滲入到組織之中時(shí)，中間的細(xì)胞已發(fā)生了變化,，抗原也隨著發(fā)生擴(kuò)散,，這種現(xiàn)象在產(chǎn)酶多的器官是比較明顯的，如胃癌,，當(dāng)切除后標(biāo)本較大,，雖然在手術(shù)室期間已放入了固定液，但固定液要透過肌層達(dá)到胃粘膜面起碼需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間,，當(dāng)固定液發(fā)揮作用時(shí),，組織已經(jīng)發(fā)生變化。因此,，這了達(dá)到免疫組織化學(xué)染色的要求,，對(duì)于離體的組織盡量快的進(jìn)行固定，有條件的應(yīng)將其剖開,，早取材,，早固定。
二,、組織脫水必須*干凈
組織塊取材不能太大過厚,，才能較好地完成脫水的過程。如果取材太厚,，在較短的時(shí)間內(nèi)脫水不*,，將可引起一系列的問題，比如浸蠟不*,，切片不好完成,，切不完整。由于先天不足,，導(dǎo)致后來切片染色的脫落,，造成染色的失敗，或者由此反復(fù)操作,，造成年人力物力的浪費(fèi),，造成病理報(bào)告的延期發(fā)出等。因此,，對(duì)取材的要求是除了要求要有藝術(shù)性外,，即平整、外觀好看,，還要求適中,。
三、切片必須完整,、均勻,、平展、無鄒折
應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色的切片,，對(duì)切片的質(zhì)量要求較高,，切片必須完整，平展,、無汽泡,，無鄒折，這樣有利在染色時(shí)的沖洗,，有利于切片的牢固附貼,。如果切片不平展,，免疫組化染色后，可出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)象,，顏色深淺不一,， 不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時(shí),，由于汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織,，在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折,，免疫組化染色后,，在鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽性,，容易引走混淆,。
四、切片的附貼必須牢固,，必須使用合適的粘貼劑,。
免疫組織化學(xué)染色前的前期準(zhǔn)備工作，就是必須對(duì)新的載玻片進(jìn)行處理,，新的載玻片表面看起來很干凈,，有人認(rèn)為不需要進(jìn)行任何的處理，都能夠適合使用,，這是一種錯(cuò)誤的想法,。新出廠的載玻片，表面復(fù)蓋著開一層油脂樣的物質(zhì),，如果不加以處理,，對(duì)切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片,，放于玻璃清洗液中浸泡4小時(shí),，然后取出，經(jīng)自來水*沖洗后,，浸入酒精中達(dá)2小時(shí)以上,，取出擦干備用或烘干也可。然后再將載玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀釋液（1：50用丙酮或無水乙醇稀釋都可以）中硅化10分鐘,，后經(jīng)無水乙醇洗2次,，烘干即可使用。
五,、切片必須烘烤附貼牢固,，既要經(jīng)得起抗原修復(fù)時(shí)高溫的作用而不使輕易脫片，又不至于破壞抗原,。
應(yīng)用于免疫組化染色的切片,。由于整個(gè)過程需經(jīng)幾個(gè)階段的處理,，如抗原修復(fù)時(shí)抗原修復(fù)液的沸騰且需持續(xù)十幾分鐘，PBS的反復(fù)沖洗,，有的甚至于4℃冰箱中孵育達(dá)十幾小時(shí),。因此,，對(duì)切片的質(zhì)量要求很高,，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤30-60分鐘即可按此進(jìn)行結(jié)果是切片掉片嚴(yán)重,，切片松動(dòng)率占100%,。切片究竟烘烤多長時(shí)間才合適，既不脫片和適合各項(xiàng)要求,，又不至于破壞抗原,。幾組實(shí)驗(yàn)［］診斷P173認(rèn)為，切片在60℃的恒溫干燥箱中烘烤2-5小時(shí)zui為合適,。這是因?yàn)椋嚎乖赡褪苋绱说臏囟?，病理科一般使用的石蠟，其熔點(diǎn)在60℃左右,，組織浸蠟時(shí),，浸蠟箱中的溫度，一般都調(diào)在65℃左右,，組織在這樣溫度中要浸泡2小時(shí)以上,，才能達(dá)到*地浸蠟。組織中的抗原已經(jīng)受了65℃的溫度考驗(yàn),，保存下來的抗原,，都已具有耐熱性。另外,，經(jīng)上述時(shí)間烘烤出來的切片,，附貼牢固，抗原保存好,，染色成功率達(dá)100%,，保證了病理診斷的及時(shí)性和準(zhǔn)確性。
特需要注意的是,，不管是應(yīng)用于診斷的切片還是研究用的切片,，烘烤后應(yīng)盡快進(jìn)行染色。如果切片切完后,，遲遲不進(jìn)行染色,，存放于室溫中或工作冰箱中，切片中的抗原將會(huì)隨著時(shí)間的延長而逐漸消失,，甚至出現(xiàn)假陰性,。原則上是新鮮切片,，即行染色，染多少張切多少張,，這樣才能盡可能的保存表達(dá)更多的抗原,。
六、切片脫蠟必須干凈,，否則將會(huì)影響免疫組化染色的zui后結(jié)果,。
蠟不溶于水，不與其它的臨床使用的抗體相融合,。它只能靠特用的試劑,，處理足夠的時(shí)間，才能將其除去,。如果脫蠟不干凈,，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起許多弊病,，如染色不均勻,，陽性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，真假難辨,，背景染色增加等,。為了解決上述的問題，切片在染色前必須*脫蠟,，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯,，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短,。較受使用者的青睞,。脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同,。如果在夏天,，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮,，則脫蠟時(shí)間不需很多,，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天,，室溫較低,，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長,，10-20分鐘或更長,。總之，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié),，不同的室溫,，不同的試劑來決定，脫蠟的時(shí)間,，原則上是要*,，干凈，*地脫去切片上的蠟,。為了做到這一步,，切片在脫蠟前的加溫將有助于完成上述的要求。比如：當(dāng)天切的切片,，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色,，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過程,，如果預(yù)先切好烤好的切片,，在染色前，還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫10-20分鐘,，然后再行脫蠟,，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好,。
七,、必須*抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性，才能降低背景的染色,。
在各種組織中都含有很多的內(nèi)源性過氧化物酶,，尤其在紅細(xì)胞，中性粒細(xì)胞,，單核細(xì)胞嗜酸性細(xì)胞,，出血的組織壞死的組織等等。含有這種酶的各細(xì)胞和組織如果在染色前不對(duì)其進(jìn)行處理和抑制,，它們將會(huì)在DAB底物的顯色時(shí),，與HRP一樣催化底樣，使之顯色,，使之生成與陽性物一樣的黃棕色,，造成混亂。為止,，在免疫組化染色前,，都必須對(duì)內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行抑制。當(dāng)然,，對(duì)它們進(jìn)行*的消除是不行的,，因?yàn)橐种铺珔柡Γ瑢?duì)抗原也會(huì)有相同的抑制作用。氫在抑制內(nèi)源性過氧化物酶時(shí),，也要注意對(duì)抗原的保護(hù)抑制也只能對(duì)它們中的大部分在DAB顯色后,，顯示出淡黃*色，這就足以與真正陽性物的區(qū)別,。抑制劑常用的是0.3%的H2O2,，也可將其稱為1%H2O2，因?yàn)槭惺鄣腍2O2的濃度為30%,，按其凈含量則為0.3%,，如果按其溶液的用量則為1%。