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撫生試劑-ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因分析
閱讀：125 發(fā)布時(shí)間：2014-4-9ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因分析
【摘要】：ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，是一種常用的固相酶免疫測(cè)定方法,。Engvall 和Perlmann于1971年zui先應(yīng)用該法進(jìn)行了IgG定量測(cè)定,，并命名為"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。 ELISA的基本原理是： ①使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面,，并保持其免疫活性,； ②使抗原（或抗體）與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原（或抗體），而且此酶標(biāo)抗原（或抗體）既保留其免疫活性,，又保留其酶活性,；
相關(guān)專(zhuān)題 ELISA免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù) ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，是一種常用的固相酶免疫測(cè)定方法,。Engvall 和Perlmann于1971年zui先應(yīng)用該法進(jìn)行了IgG定量測(cè)定,，并命名為"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。 ELISA的基本原理是：
①使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面,，并保持其免疫活性,；
②使抗原（或抗體）與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原（或抗體），而且此酶標(biāo)抗原（或抗體）既保留其免疫活性,，又保留其酶活性,；
③測(cè)定時(shí)將受檢標(biāo)本（抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原（或抗體）按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng)，再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開(kāi),，zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢的抗體或抗原量成一定比例,；再加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物,，根據(jù)其顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析,，以了解被測(cè)標(biāo)本中抗體或抗原含量。
elisa方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定,。但ELISA測(cè)定中影響因素較多,，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在臨床檢驗(yàn)中除正常反應(yīng)外,，有時(shí)?？梢?jiàn)到一些錯(cuò)誤結(jié)果（即假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果）。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：
①標(biāo)本因素,；
②試劑因素,；
③操作因素。
本文就標(biāo)本因素對(duì)ELISA測(cè)定的影響做如下討論,。
血清是zui常用的ELISA標(biāo)本,，血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本,，標(biāo)本引起的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：
1． 內(nèi)源性物質(zhì) 有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì),，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果,。常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體,、嗜異性抗體,、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體,、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等,。
（1）類(lèi)風(fēng)濕因子
人血清中IgM、IgG型類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合,，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性,。
解決該情況的辦法是：
①用F(ab)2替代完整的IgG；
②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性（63℃,，10 min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效）,；③檢測(cè)抗原時(shí)，可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中,，使RF降解,。
（2）補(bǔ)體 ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過(guò)程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu),，其FC段的補(bǔ)體C1q分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來(lái),，使C1q 可以將二者連接起來(lái)，從而造成假陽(yáng)性,。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本,；②用53℃，10 min或56℃,，30 min加熱血清使C1q滅活,。
（3）嗜異性抗體 人類(lèi)血清中含有能與嚙齒類(lèi)動(dòng)物（如鼠等）Ig (s) 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來(lái),，也能造成假陽(yáng)性,。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過(guò)量的動(dòng)物Ig (s) ，但加入量不足或亞類(lèi)不同時(shí)無(wú)效,。
（4）嗜靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白,、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物,，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果。為避免以上情況出現(xiàn),，解決的辦法是：測(cè)定前需用理化方法將其解離后再測(cè)定,。
（5）醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s) 抗體 臨床開(kāi)展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療,，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使這些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體,；另外,，被鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig (s) 抗體。這些病人ELISA測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽(yáng)性,。解決的辦法是：測(cè)定抗原時(shí),，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig (s) ，從而克服由于上述原因造成的假陽(yáng)性,。
（6）交叉反應(yīng)物質(zhì) 類(lèi)地高辛,、類(lèi)AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì),。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大,，但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí)，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定簇時(shí),，也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,。
（7）標(biāo)本中其它成分的影響 血清脂質(zhì)過(guò)高、膽紅素,、血紅蛋白及血液粘度過(guò)大等,，均對(duì)ELISA測(cè)定結(jié)果有干擾作用。
2． 外源性物質(zhì)
外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測(cè)定的血標(biāo)本的采集,、貯存等不當(dāng)所致,。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染,、標(biāo)本貯存過(guò)久,、標(biāo)本凝集不全和采血管中添加物等影響。
（1）標(biāo)本溶血 由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血,，均可因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)釋放出大量具有過(guò)氧化物酶活性的血紅蛋白,，在以辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色,，干擾測(cè)定結(jié)果,。為克服上述干擾作用，標(biāo)本采集時(shí)必須注意避免溶血,。
（2）標(biāo)本受細(xì)菌污染 因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶,，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣,，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果,。
（3）標(biāo)本保存不當(dāng) 在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體,，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深,、甚至造成假陽(yáng)性；標(biāo)本放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（如一天以上）,，有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱,，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾,，ELISA測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集,；如不能立即測(cè)定，5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4℃,，1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存,；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮,，分布不均,，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔,，不可強(qiáng)烈振蕩,。
（4）標(biāo)本凝集不全 在沒(méi)有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2~2h開(kāi)始凝固,，18~24h*凝固,。臨床檢驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè),，常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清,，此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊,，易造成假陽(yáng)性結(jié)果,；這類(lèi)情況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已*，血清中不再有纖維蛋白原存在,，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮?。為避免上述干擾作用，解決的辦法是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清,，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?br />（5）標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響 抗凝劑（如肝素,，EDTA）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性）及快速分離血清的分離膠等均對(duì)ELISA測(cè)定有一定干擾作用,。 綜上所述,，對(duì)臨床檢驗(yàn)ELISA測(cè)定中出現(xiàn)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，在考慮試劑因素和操作因素之外,，更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進(jìn)行分析,，并應(yīng)采取相應(yīng)措施排除干擾作用，從而為臨床提供正確可靠的檢測(cè)結(jié)果。