化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
人彈力蛋白酶-1（FE-1）ELISA檢測試劑盒說明書
閱讀：962 發(fā)布時(shí)間：2012-12-4使用說明書檢測原理試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被人彈力蛋白酶-1（FE-1）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人彈力蛋白酶-1（FE-1）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度,。樣品收集,、處理及保存方法1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。3. 細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。自備物品1. 酶標(biāo)儀（450nm）2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL3. 37℃恒溫箱操作注意事項(xiàng)1. 試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用,。2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。3. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液即可視為陰性對照或者空白；預(yù)處理后的樣本無需稀釋,，直接取10μL加樣即可,。4. 嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。5. 所有液體組分使用前充分搖勻。試劑盒組成名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標(biāo)板12孔×8條12孔×4條無
標(biāo)準(zhǔn)品（240 U/mL）0.6mL 0.6mL 按說明書進(jìn)行稀釋
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液6mL3mL無
樣本稀釋液6mL3mL無
檢測抗體-HRP10mL5mL無
20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進(jìn)行稀釋
底物A6mL3mL無
底物B6mL3mL無
終止液6mL3mL無
封板膜2張2張無
說明書1份1份無
自封袋1個(gè)1個(gè)無
注：標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為：240,、120,、60、30,、15,、7.5 U/mL試劑的準(zhǔn)備 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。洗板方法1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次。2. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5次,。操作步驟1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；3. 待測樣本孔先加待測樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL,；4. 隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。5. 棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。6. 每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。7. 每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。結(jié)果判斷 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中,，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值,。