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實時熒光定量PCR( qPCR)探針類方法具體表現(xiàn)
閱讀:165 發(fā)布時間:2025-5-14實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, qPCR)的化學原理主要包括兩種類型:探針類和非探針類,。其中,探針類方法具體包括:
TaqMan 探針法:
原理:在PCR反應體系中,,加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針,。探針兩端分別標記一個熒光報告基團和一個淬滅基團。探針完整時,,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,,PCR儀檢測不到熒光信號;PCR擴增時,,Taq酶的5' - 3'外切酶活性將探針酶切降解,,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成全同步,,這是定量的基礎(chǔ)。
優(yōu)點:具有高度特異性,,重復性好,,熒光信號強,適合進行基因拷貝數(shù)的確定,,尤其是在臨床診斷中,,如病毒和病原菌定量檢測。
缺點:只適合一個特定的目標,,探針價格較高,。
分子信標技術(shù):
原理:分子信標是一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熒光探針,兩端分別標記有報告基團和淬滅基團,。在游離狀態(tài)下,,報告基團與淬滅基團靠近,熒光信號被淬滅,。當與目標序列結(jié)合時,,發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,報告基團與淬滅基團分離,,發(fā)出熒光信號,。
優(yōu)點:具有高度特異性,,能夠區(qū)分成熟microRNA分子和前體分子以及其它成熟microRNA的同源分子,適用于高通量的SNP檢測,。
缺點:設計復雜,,需要特定的序列信息。
FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)技術(shù):
原理:利用兩個熒光基團之間的能量轉(zhuǎn)移來檢測PCR產(chǎn)物,。一個基團作為供體,,另一個作為受體。當它們在一定距離內(nèi)時,,供體的熒光能量可以轉(zhuǎn)移到受體,,產(chǎn)生特定的熒光信號。
優(yōu)點:可以實現(xiàn)多重反應,,適用于同時檢測多個基因,。
缺點:設計和應用相對復雜。
這些探針類方法通過特異性地結(jié)合或檢測PCR產(chǎn)物,,提供了高度的特異性和準確性,,但通常需要設計特定的探針,且成本相對較高,。