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實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR, qPCR）的化學(xué)原理主要包括兩種類型：探針類和非探針類,。其中,，探針類方法具體包括：

TaqMan 探針法：

原理：在PCR反應(yīng)體系中,，加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針,。探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán),。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,，PCR儀檢測(cè)不到熒光信號(hào),；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5' - 3'外切酶活性將探針酶切降解,，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成全同步,，這是定量的基礎(chǔ),。

優(yōu)點(diǎn)：具有高度特異性，重復(fù)性好,，熒光信號(hào)強(qiáng),，適合進(jìn)行基因拷貝數(shù)的確定，尤其是在臨床診斷中,，如病毒和病原菌定量檢測(cè),。

缺點(diǎn)：只適合一個(gè)特定的目標(biāo)，探針價(jià)格較高。

 

分子信標(biāo)技術(shù)：

原理：分子信標(biāo)是一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熒光探針,，兩端分別標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán),。在游離狀態(tài)下，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)靠近,，熒光信號(hào)被淬滅,。當(dāng)與目標(biāo)序列結(jié)合時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離,，發(fā)出熒光信號(hào)。

優(yōu)點(diǎn)：具有高度特異性,，能夠區(qū)分成熟microRNA分子和前體分子以及其它成熟microRNA的同源分子,，適用于高通量的SNP檢測(cè)。

缺點(diǎn)：設(shè)計(jì)復(fù)雜,，需要特定的序列信息,。

 

FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）技術(shù)：

原理：利用兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移來檢測(cè)PCR產(chǎn)物。一個(gè)基團(tuán)作為供體,，另一個(gè)作為受體,。當(dāng)它們?cè)谝欢ň嚯x內(nèi)時(shí)，供體的熒光能量可以轉(zhuǎn)移到受體,，產(chǎn)生特定的熒光信號(hào),。

優(yōu)點(diǎn)：可以實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)，適用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因,。

缺點(diǎn)：設(shè)計(jì)和應(yīng)用相對(duì)復(fù)雜,。

 

這些探針類方法通過特異性地結(jié)合或檢測(cè)PCR產(chǎn)物，提供了高度的特異性和準(zhǔn)確性,，但通常需要設(shè)計(jì)特定的探針,，且成本相對(duì)較高。