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細胞凍存實驗必看干貨分享
閱讀：82 發(fā)布時間：2025-3-24一,、實驗原理
細胞凍存隨著溫度降低,，細胞內(nèi)的酶活性會逐漸降低，到-80℃左右,，酶活性幾乎為0,，代謝活動停止，可以實現(xiàn)長期保存,。然而,，隨著溫度降低，細胞內(nèi)外的水分也會“結(jié)冰"并形成冰晶,，冰晶能導(dǎo)致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷,、電解質(zhì)升高、滲透壓改變,、脫水,、pH改變、蛋白變性等,，能引起細胞死亡,。因此常加入冷凍保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點,，延緩凍存過程,，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內(nèi)離子濃度,，減少細胞內(nèi)冰晶的形成,，從而達到保護細胞的目的。
二,、實驗前準(zhǔn)備
1.細胞：選擇處于對數(shù)生長期（一般密度為80%-95%,，不要使細胞長得過密）、狀態(tài)良好且無污染的細胞進行凍存,。在凍存前一天，更換新鮮的全培養(yǎng)基,，確保細胞處于最佳生長狀態(tài),。
2.培養(yǎng)基：準(zhǔn)備適量的細胞培養(yǎng)所用的全培養(yǎng)基，根據(jù)細胞類型確定其配方,，如 RPMI-1640,、DMEM 等，并添加10%的胎牛血清（FBS）,，根據(jù)細胞不同,，血清濃度可能會有變化，具體以培養(yǎng)細胞時需要的血清濃度為準(zhǔn),。
3.凍存液：
（1）一般使用含有 90% 全培養(yǎng)基 和 10% 二甲基亞砜（DMSO）的凍存液,。DMSO 需提前預(yù)冷至 4℃以下，且要確保其質(zhì)量和純度,，避免對細胞造成損傷,。將凍存液在冰上或 4℃冰箱中配制，輕輕混勻,。
（2）使用商品化的細胞凍存液,，凍存液使用前保存在4℃冰箱。
4.凍存管：選用無菌,、無 DNase 和 RNase,、耐低溫的凍存管。在凍存管上清晰標(biāo)記細胞名稱,、凍存日期,、細胞代數(shù)等重要信息，以便后續(xù)識別和使用,。
5.水平離心機：確保離心機的轉(zhuǎn)速和離心力準(zhǔn)確可靠,，能夠達到 1000 - 1500 rpm 的轉(zhuǎn)速，用于細胞沉淀收集。提前清潔和消毒離心機轉(zhuǎn)頭及離心管套筒,，防止交叉污染,。
6.其他耗材：準(zhǔn)備無菌的移液槍及配套槍頭，不同量程的移液槍應(yīng)經(jīng)過校準(zhǔn)且在有效期內(nèi),。槍頭需為無菌,、無熱原的一次性耗材，避免對細胞產(chǎn)生污染,。同時,，準(zhǔn)備適量的 PBS 緩沖液用于細胞洗滌，PBS 緩沖液需提前預(yù)熱至 37℃,。
三,、操作步驟
1. 細胞收集：
1）.以T25瓶為例，在超凈工作臺中,，先將培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基輕輕吸出,，用預(yù)熱至 37℃的 PBS 緩沖液緩慢沖洗細胞 2 - 3 次，每次沖洗時 PBS 緩沖液的用量以能覆蓋細胞單層為宜,，一般為 5 - 10 ml,。沖洗的目的是去除殘留的培養(yǎng)基和血清，減少其對后續(xù)凍存過程的影響,。
2）.然后加入適量的胰酶-EDTA 溶液（根據(jù)細胞類型和培養(yǎng)瓶大小確定用量,，一般 T25培養(yǎng)瓶加入1 ml）
3）.將培養(yǎng)瓶置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 1 - 5 分鐘。在消化過程中,，需密切觀察細胞形態(tài)變化,。當(dāng)細胞開始變圓、收縮并逐漸從培養(yǎng)容器底部脫離時,，用手輕輕拍打培養(yǎng)容器的側(cè)壁,，幫助細胞全脫落。不同細胞類型的消化時間會有所不同,，例如,，一些上皮細胞可能需要3-5分鐘左右，而一些成纖維細胞可能需要2-4分鐘左右,。
4）.用移液槍輕輕吹打細胞懸液,，使細胞充分脫離培養(yǎng)瓶底部并分散均勻，避免產(chǎn)生過多氣泡,。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中,。
2. 細胞計數(shù)與離心：
1).取少量細胞懸液，使用血細胞計數(shù)板或細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù),，計算細胞濃度和活率,。
2).根據(jù)細胞濃度、活率和所需凍存的細胞數(shù)量，調(diào)整細胞懸液體積,；一般凍細胞的密度為1×10^6 - 5×10^6個/ml,。
3).將離心管放入離心機中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為1000 rpm,，離心5分鐘,。
4).離心結(jié)束后，小心取出離心管,，將其置于超凈工作臺中,，緩慢吸出上清液，盡量避免吸到細胞沉淀,。
3. 凍存液重懸細胞：
1).根據(jù)細胞沉淀的量,，加入適量預(yù)冷的凍存液，一般按照1×10^6 - 5×10^6個/ml細胞密度進行重懸,。
2).用移液槍輕輕吹打細胞沉淀,，使細胞均勻分散在凍存液中，確保細胞密度適中,，避免細胞團聚。
3).重懸后的細胞,，盡量減少細胞存放于室溫的時間,，盡快進入凍存階段。
4. 細胞分裝與凍存：
1).將重懸后的細胞懸液分裝至標(biāo)記好的凍存管中,，每管分裝的細胞懸液體積一般為 1 - 1.5 ml,。在分裝過程中，要注意避免產(chǎn)生氣泡,，同時確保凍存管密封良好,。
2).由于使用的凍存方式不同會有不同的凍存方法，請選擇合適的凍存步驟,。
a. 使用傳統(tǒng)方法：將凍存管先放入 4℃冰箱中靜置60 分鐘,，使細胞逐漸適應(yīng)低溫環(huán)境。然后將凍存管轉(zhuǎn)移至 -20℃冰箱中放置2小時,，接著再放入-80℃冰箱過夜,。最后，將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中進行長期保存,。在轉(zhuǎn)移過程中,，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環(huán)境中的停留時間，防止細胞受損,。
b. 使用凍存盒：將凍存管放入4℃預(yù)冷的凍存盒（確保凍存盒已加滿或更新異丙醇）中,，然后快速將凍存管轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜。最后，將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中進行長期保存,。在轉(zhuǎn)移過程中,，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環(huán)境中的停留時間，防止細胞受損,。
c. 使用細胞凍存液：將凍存管轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜,，然后將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐中進行長期保存。在轉(zhuǎn)移過程中,，要盡量縮短凍存管在室溫及 -20℃以上環(huán)境中的停留時間,，防止細胞受損。