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聚合酶鏈反應(PCR)實驗問題解析
閱讀：195 發(fā)布時間：2025-2-18聚合酶鏈反應(PCR)技術是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應,。PCR的原理是在模板DNA,、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當濃度的Mg2+存在的條件下,，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應,。兩個引物分別位于靶序列兩端,，同兩條模板的3’端互補，由此限定擴增片段,。PCR反應由一系列的變性→退火→延伸反復循環(huán)構成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈,，然后在較低溫度下同過量引物退火,，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸。理論上,，經過N次循環(huán)可使特定片段擴增到2n-1,，考慮到擴增效率達不到100%，所以通常經25到30次循環(huán)可擴增到106倍,，足夠后續(xù)實驗展開,。
常見問題分析與解決方法：
1、 無擴增條帶
1),、 酶失活或在反應體系中未加入酶,。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果,。
2),、模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果,。
3)、 變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符,，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活,；過低則模板變性不徹di。
4),、反應系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶,，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5-10 min,。
5),、 引物變質失效。人工合成的引物是否正確,。是否純化,，或因儲存條件不當而失活。
6),、 引物錯誤,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。
7),、 DNA凝膠電泳時加入陽性對照,，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題,。
2、PCR產物量過少
1),、退火溫度不合適,。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。
2),、 DNA模板量太少,。增加DNA模板量。
3),、 PCR循環(huán)數(shù)不足,。增加反應循環(huán)數(shù)。
4),、 引物量不足,。增加體系中引物含量。
5),、延伸時間太短,。以1 kb/min的原則設置延伸時間。
6),、 變性時間過長,。變性時間過長會導致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑,。確保DNA模板干凈,。
3、擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
1),、酶量過高,。減少酶量；酶的質量差,，調換另一來源的酶,。
2)、dNTP濃度過高,。減少dNTP的濃度,。
3)、 MgCl2濃度過高,?？蛇m當降低其用量。
4),、 模板量過多,。質粒DNA的用量應<50 ng，而基因組DNA則應<200 ng。
5),、 引物濃度不夠優(yōu)化,。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。
6),、 循環(huán)次數(shù)過多,；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時間及延伸時間,，或改用二種溫度的PCR循環(huán),。
7)、 退火溫度過低,。
8),、 電泳體系有問題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大,；
②凝膠沒有凝固好,；
③瓊脂糖質量差。
9）,、若為PCR試劑盒則可能：
① 由于運輸儲存不當引起試劑盒失效,；
② 試劑盒本身質量有問題，如引物選擇,、循環(huán)參數(shù)等選擇不當,。
10）、降解的陳舊模板擴增也易產生涂布,。
4,、擴增產物出現(xiàn)多條帶(雜帶)
1)、 引物用量偏大,，引物的特異性不高,。應調換引物或降低引物的使用量。
2),、 循環(huán)的次數(shù)過多,。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù),。
3) ,、酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶,。
4),、退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長,。應提高退火溫度,，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增,。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度,。
5),、樣品處理不當。
6),、 Mg2+濃度偏高,，因適當調整Mg2+使用濃度。
7),、若為PCR試劑盒,，也可能時試劑盒本身質量有問題。
8),、 復制提前終止,。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶,。
9),、 反應緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化全并徹di混勻,。
10),、 引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物,。
11),、 引物量過多。減少反應體系中引物的用量,。
12),、 模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng,，而基因組DNA則應<200ng,。
13)、外源DNA污染,。確保操作的潔凈,。
5、 陰性對照出現(xiàn)條帶
試劑,，槍頭,，工作臺污染。使用全新的試劑和槍頭,，對工作臺進行清潔,。
6.、條帶大小與理論不符
1) ,、污染,。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。
2) ,、模板或引物使用錯誤,。更換引物和模板。
3) ,、基因亞型,。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。