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RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶與合成 cDNA 引物的選擇
閱讀：149 發(fā)布時間：2024-12-9逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,，RT-PCR) 的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總 RNA,，以其中的 mRNA 作為模板,，采用 Oligo（dT） 或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。再以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增,，而獲得目的 基因或檢測基因表達(dá),。RT-PCR 使 RNA 檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量 RNA 樣品分析成為可能,。
一,、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性，RNA 酶 H 活性相對 較弱,。最適作用溫度為 37℃,。
2．禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。最適作用 溫度為 42℃,。
3．Thermus thermophilus,、Thermus flavus 等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在 Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄 RNA,，以消除 RNA 模板的二級結(jié)構(gòu),。
4．MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H-突變體：商品名為 Superscript 和 SuperScriptⅡ。此種 酶較其它酶能多將更大部分的 RNA 轉(zhuǎn)換成 cDNA,，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的,、低溫反 轉(zhuǎn)錄很困難的 mRNA 模板合成較長 cDNA。
二,、合成 cDNA 引物的選擇
1． 隨機六聚體引物：當(dāng)特定 mRNA 由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時,，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長 mRNA,。用此種方法時，體 系中所有 RNA 分子全部充當(dāng)了 cDNA 第一鏈模板,，PCR 引物在擴增過程中賦予所需要的 特異性,。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%來源于 rRNA。
2． Oligo(dT)：是一種對 mRNA 特異的方法,。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾,，此引物與其配對，僅 mRNA 可被轉(zhuǎn)錄,。由于 Poly(A+)RNA 僅占總 RNA 的 1-4%,，故此種引物合成的 cDNA 比隨機六聚體作為引物和得到的 cDNA 在數(shù)量和復(fù)雜性 方面均要小。
3． 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo) RNA 的互補序列的寡核苷酸作為引物,， 若 PCR 反應(yīng)用二種特異性引物,，第一條鏈的合成可由與 mRNA 3’端最靠近的配對引物起 始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的 cDNA,，導(dǎo)致更為特異的 PCR 擴增,。