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酶聯(lián)免疫吸附ELISA實(shí)驗(yàn)檢測目的抗原方法講解
閱讀：210 發(fā)布時(shí)間：2024-11-13 ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)是一種廣泛應(yīng)用在測定液體樣本中的蛋白,、抗體,、或激素的免疫分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序,，通常是把蛋白,、抗體、或激素等（即抗原）直接或是以捕捉抗體（capture Ab）固定在固相載體上，再加入一級(jí)檢測抗體（primarydetection Ab）,，形成一個(gè)抗原抗體的復(fù)合物,。如果該抗體已經(jīng)用酶（enzyme）標(biāo)記了，即可用來直接測定抗原的量,，若無,，則可利用另一個(gè)酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來測定抗原的量。測定抗原量的方法是加入該酶的底質(zhì)（substrate）,，作用后產(chǎn)生出現(xiàn)的顏色深淺和樣本中的抗原量呈正比的關(guān)系,，依此原理計(jì)算出樣本中的抗原總量或濃度。ELISA生物試驗(yàn)是一種敏感性高,，特異性強(qiáng),，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。
ELISA的主要原理：
1,、包被 抗原或者抗體能以物理性吸附于固相載體表面,，可能原理是蛋白質(zhì)和聚苯C2H4表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗體反應(yīng)等免疫活性,；
2,、標(biāo)記 抗原或者抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特點(diǎn),；
3,、顯色 酶結(jié)合物與相應(yīng)包被在固相載體的抗原或者抗體結(jié)合后，也被固定在固相載體上,，加入酶的底物之后可出現(xiàn)顯色反應(yīng),，根據(jù)反應(yīng)的顏色深淺可計(jì)算抗原或者抗體的相對(duì)含量。
一,、ELISA雙抗夾心法
雙抗夾心法針對(duì)至少2個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原,。首先介紹一下抗原決定簇，抗原決定簇就是決定抗原性的特殊化學(xué)基團(tuán),，也叫抗原表位,，理論上一個(gè)抗原決定簇能誘導(dǎo)產(chǎn)生一種單克隆抗體（可能有童鞋又要問單克隆抗體是神馬東東了，以后介紹?。?。由6－12氨基酸或碳水基團(tuán)組成，它可以是由連續(xù)序列（線性表位）組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)（構(gòu)象表位）組成,。臨床上具有2個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原有很多,，比較常見有HBsAg、AFP,、HCG等大分子抗原,。檢測步驟也簡單,，就是包被、洗滌,、加樣,、洗滌、加樣,、洗滌,、顯色。具體說來是先將純化的相應(yīng)抗體包被在固相載體上,，再加入待測樣品，若其中含有待測抗原就會(huì)與固相抗體結(jié)合,，洗掉雜質(zhì)后,，再加入酶標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗掉多于的酶標(biāo)抗體后,，加入底物顯色,，顯色與否以及顏色的深淺就代表了待測抗原是否存在以及相對(duì)含量了。
對(duì)于雙抗夾心法檢測大分子抗原要注意幾點(diǎn)：
1.固相抗體和酶標(biāo)檢測抗體一定是分別針對(duì)待測抗原的兩個(gè)不同抗原決定簇,，不然兩個(gè)抗體就會(huì)為爭同一個(gè)決定簇而打架,，會(huì)出現(xiàn)假陰性的不良結(jié)果；
2.如果檢測的樣本是血清,，就要注意風(fēng)濕病患者體內(nèi)內(nèi)風(fēng)濕因子RF這種奇葩異種抗體的存在,，它能夠神奇地結(jié)合固相抗體和檢測抗體，造成假陽性的不良結(jié)果,；
3.包被的固相抗體含量一定是高于樣品中的抗原含量,，不然檢測到的含量會(huì)比實(shí)際含量低；
4.如果想省事一些,，將待測樣品與酶標(biāo)檢測抗體同時(shí)加入固相載體,，在酶標(biāo)檢測抗體高于樣品中的待測抗原的情況下，會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果,，這種現(xiàn)象書本叫鉤狀效應(yīng),。
競爭法針對(duì)小分子抗原,。這種方法也可以用于大分子抗原,，只是相對(duì)雙抗夾心法這種強(qiáng)悍的策略，競爭法全沒有優(yōu)勢,，所以競爭法只在檢測小分子這個(gè)邊緣地帶發(fā)揮余熱了,。臨床上主要用于T3、T4,、孕酮等激素以及藥物等,。檢測步驟與雙抗夾心法更簡單,，包被、洗滌,、加樣,、洗滌、顯色,，少了一步加樣的過程,，但是設(shè)計(jì)上復(fù)雜一些，首先將純化的相應(yīng)抗體包被在固相載體上,，然后每組樣本需要分兩組,，一組同時(shí)加入事先混勻好的酶標(biāo)檢測抗原和樣本的混合物，一組只加入酶標(biāo)記抗原,，兩組顏色只差便是待測抗原的含量,。
對(duì)于競爭法也需要注意一點(diǎn)，酶標(biāo)記抗原和待測樣本一定要事先混勻好,，然后同時(shí)加入固相載體,，不然會(huì)造成bu公平競爭，檢測出現(xiàn)偏差,。
利用干擾實(shí)驗(yàn)即可辨別ELISA試劑盒是否檢測目的抗原,，方法如下：
1、將針對(duì)試劑盒特異性的重組蛋白抗原和試劑盒中的檢測抗體配置成antibody: antigen≈1:2的混合孵育液,；
2,、37℃孵育15分鐘后，代替原試劑盒中的檢測抗體,；
3,、后續(xù)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，加檢測抗體,、酶復(fù)合物和底物
4,、實(shí)驗(yàn)完畢后，檢測其標(biāo)準(zhǔn)曲線,，如果標(biāo)準(zhǔn)曲線良好則說明加入的目的抗原和試劑盒抗體不匹配,，試劑盒檢測抗體針對(duì)的是非目的抗原，該試劑盒為偽劣假造elisa試劑盒,。
5,、如果標(biāo)準(zhǔn)曲線無線性，則說明試劑盒檢測抗體已被目的抗原中和或干擾,，影響了其實(shí)際試劑盒抗體的檢測作用,，則該試劑盒檢測抗體針對(duì)的是目的抗原。