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各類聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)特性及缺點(diǎn)
閱讀：269 發(fā)布時(shí)間：2024-10-21PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),，是體外DNA擴(kuò)增技術(shù)之一,，至今已經(jīng)超過30年的歷史。
PCR基本原理：
PCR可以將目標(biāo)DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上,，其原理是在DNA聚合酶催化下,，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn),，通過變性,、退火、延伸等步驟,，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程,。
標(biāo)準(zhǔn) PCR 過程分為三步：
1.變性（Denaturation）：利用高溫使DNA 雙鏈分離。DNA雙鏈之間的氫鍵在高溫下（93- 98℃）被打斷,。
2.退火（Annealing）：在 DNA 雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA 上。
3.延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物處開始沿著DNA 鏈合成互補(bǔ)鏈,，延伸完成,，則完成一輪循環(huán)，DNA片段數(shù)增加一倍,。
往復(fù)循環(huán)這三個(gè)步驟25-35 次,，DNA 片段數(shù)將得到指數(shù)級(jí)增加。
PCR的巧妙之處在于針對(duì)不同的目標(biāo)基因可以設(shè)計(jì)不同的引物,，使目標(biāo)基因片段在短時(shí)間內(nèi)得到百萬級(jí)的放大,。
目前為止，PCR可以分為三類,，分別是普通PCR,、熒光定量PCR和數(shù)字PCR。
第一代普通PCR
采用普通PCR 擴(kuò)增儀來對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增,，然后采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測,，只能做定性分析。
第一代PCR主要缺點(diǎn)：
容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增和假陽性結(jié)果,。
檢測耗時(shí)長,，操作繁瑣。
只能做定性檢測。
第二代熒光定量PCR
熒光定量PCR（Real-Time PCR）,，也叫做qPCR,，通過在反應(yīng)體系中加入能夠指示反映進(jìn)程的熒光探針，通過熒光信號(hào)的積累來監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的積累,，通過熒光曲線來判斷結(jié)果，并可以借助Cq 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量,。
qPCR 技術(shù)由于操作過程在封閉體系中進(jìn)行,，降低了污染概率，并且可以通過對(duì)熒光信號(hào)監(jiān)測從而進(jìn)行定量檢測,，因此臨床應(yīng)用最為廣泛,，已成為PCR中的主導(dǎo)技術(shù)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為：TaqMan熒光探針,、分子信標(biāo)和熒光染料,。
1)TaqMan熒光探針：
PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán),。
探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,；PCR擴(kuò)增時(shí),，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成,，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成全同步,。
2)SYBR熒光染料：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料,，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加全同步,。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線,，確定PCR反應(yīng)是否特異,。
3)分子信標(biāo)
是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì),，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近,，不會(huì)產(chǎn)生熒光。
PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中,，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì),，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。
第二代PCR主要缺點(diǎn)：
靈敏度還有欠缺,，低拷貝標(biāo)本檢測不準(zhǔn)確,。
存在背景值影響，結(jié)果易受干擾,。
當(dāng)反應(yīng)體系中有PCR抑制物時(shí),，檢測結(jié)果易受干擾。
第三代數(shù)字PCR
數(shù)字PCR（DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR）通過終點(diǎn)檢測計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù),，無需采用內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測,。
數(shù)字PCR采用終點(diǎn)檢測，不依賴于Ct值（循環(huán)閾值）,，所以數(shù)字PCR反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響降低,，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力提高，具有很高的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性,。
由于具備高靈敏度,、高精確度的特點(diǎn)，不易被PCR反應(yīng)抑制劑干擾,，無需標(biāo)準(zhǔn)品可實(shí)現(xiàn)真正意義的絕對(duì)定量,，而成為研究和應(yīng)用熱點(diǎn)。
根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式,，主要可分為微流體式,、芯片式和微滴式三大類系統(tǒng)。
1)微流體數(shù)字PCR,，Microfluidic digital PCR,，mdPCR。
基于微流控技術(shù),，對(duì)DNA模板進(jìn)行分液,，微流控技術(shù)能實(shí)現(xiàn)樣品納升級(jí)或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應(yīng)體系結(jié)合,，mdPCR已逐漸被其他方式取代,。
2)微滴數(shù)字PCR，Droplet-based digital PCR,，ddPCR,。
利用油包水微滴生成技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個(gè)納升級(jí)的微滴,，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子,，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子,。
第三代PCR主要缺點(diǎn)：
儀器和試劑昂貴。
模板質(zhì)量要求較高,，模板量超過微體系量將導(dǎo)致無法定量,，過少則定量準(zhǔn)確度降低。
當(dāng)存在非特異性擴(kuò)增時(shí)也會(huì)產(chǎn)生假陽性,。
PCR的各種延伸技術(shù)
1.遞減PCR（touchdown PCR）：前幾循環(huán)溫度逐漸下降,。
2.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來的cDNA 為模板，也因?yàn)槭菑谋憩F(xiàn)型基因來進(jìn)行增量的,，由此產(chǎn)生出來的cDNA 產(chǎn)物不帶有內(nèi)含子（基因中不具意義的段落）,，常應(yīng)用于分子克隆技術(shù)。
3.熱啟動(dòng)PCR（hotstart PCR）：以高熱激活型核酸聚合酶進(jìn)行反應(yīng),，減少非專一性產(chǎn)物。
4.巢式PCR（nested PCR）：先用低特異性引物擴(kuò)增幾個(gè)循環(huán)以增加模板數(shù)量,，再用高特異性引物擴(kuò)增,。
5.多重PCR（multiplex PCR）：在同一個(gè)管中使用多組引物。
6.復(fù)原條件PCR（reconditioning PCR）：PCR 產(chǎn)物稀釋 10 倍后重新放入原濃度的引物和dNTP 等循環(huán) 3 次,，以消除產(chǎn)物中的異二聚體,。
7.dsRNA 合成（dsRNA replicator）：合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase,；從雙股 DNA轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)的雙股RNA（dsRNA）,。可應(yīng)用于RNAi實(shí)驗(yàn)操作,。
8.COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR):用以檢測突變或特殊等位基因的PCR 應(yīng)用技術(shù),。