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BCA 蛋白定量檢測試劑盒測蛋白濃度步驟
閱讀：457 發(fā)布時間：2024-9-19取適量未變性的總蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量檢測試劑盒（G2026-200T,；G2026-1000T）測蛋白濃度，蛋白樣品在進行SDS-PAGE電泳等實驗研究之前要進行精確的定量,，以保證同一實驗中不同樣品之間上樣量的一致性以及結果可比性,。因此，蛋白濃度測定是研究蛋白中常用,、最基本的分析技術之一,。
BCA原理：在堿性條件下，蛋白質分子中的肽鍵結構能與Cu2+結合生成絡合物,，同時將Cu2+還原為Cu+,。BCA試劑可靈敏特異的與Cu+結合,，形成穩(wěn)定的紫色絡合物，562nm處有最高的吸收值,，可在562nm測定其吸收值,，顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，與標準曲線對比,，即可計算待測蛋白的濃度,。
蛋白濃度測定方法如下：
1.配制蛋白標準貯備液
取1 mL蛋白標準配制液加入到蛋白標準品（BSA）蛋白標準管中，將25 mg蛋白標準品全溶解,，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液,。配制成的蛋白標準溶液可-20℃長期保存。
2.配制蛋白標準工作液
取適量25 mg/mL蛋白標準貯備液,，用PBS或生理鹽水稀釋50倍,，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋,，確保稀釋準確,。
3.繪制標準曲線（酶標儀法）
將蛋白標準工作液分別按0、1,、2,、4、8,、12,、16、20 μL加到96孔板中,，然后用PBS或生理鹽水依次加20,、19、18,、16,、12、8,、4,、0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0,、25,、50、100,、200,、300、400,、500 μg/mL的梯度曲線,。
4.準備待測樣品
將待測的蛋白樣品進行適當稀釋（可通過預實驗檢測，使樣品蛋白濃度在標準曲線范圍內(nèi),，確保檢測結果可信）,，按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋,。
5.配制BCA顯色工作液
將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻,，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存,，24 h內(nèi)使用,。每個待測樣品需200 μL，建議按需配制,，避免浪費,。
6.檢測
向標準曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s）,，37℃反應30 min后,，以標準曲線0號做參比，在562 nm波長下比色測定,，記錄各孔吸光度值,。（注：也可以在室溫反應2 h，或60℃反應30 min,。如果蛋白濃度較低,，建議置于60℃反應）
7.計算
以標準曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標,，繪出標準曲線,。根據(jù)所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL）,，再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測樣品實際蛋白濃度,。
提示：
1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時間的影響較大，吸光度值會隨著時間的延長或溫度升高而變化,，如果不能精確控制顯色反應的時間和溫度,，建議每次測定都需要做標準曲線。
2. 在進行蛋白標準貯備液的配制時,，需確保溶解充分,。稀釋配制蛋白標準工作液時建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍,，以免產(chǎn)生較大誤差,。
3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標準品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液,，同保證兩者檢測條件一致,。如果緩沖液本身就有較高的背景值,，建議使用其他的方法測定。
4. 操作時請穿實驗服,，并佩戴一次性手套,。