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BCA 蛋白定量檢測試劑盒測蛋白濃度步驟
閱讀：271 發(fā)布時(shí)間：2024-9-19取適量未變性的總蛋白溶液,，用 BCA 蛋白定量檢測試劑盒（G2026-200T；G2026-1000T）測蛋白濃度,，蛋白樣品在進(jìn)行SDS-PAGE電泳等實(shí)驗(yàn)研究之前要進(jìn)行精確的定量,，以保證同一實(shí)驗(yàn)中不同樣品之間上樣量的一致性以及結(jié)果可比性。因此,，蛋白濃度測定是研究蛋白中常用,、最基本的分析技術(shù)之一。
BCA原理：在堿性條件下,，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)能與Cu2+結(jié)合生成絡(luò)合物,，同時(shí)將Cu2+還原為Cu+。BCA試劑可靈敏特異的與Cu+結(jié)合,，形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物,，562nm處有最高的吸收值，可在562nm測定其吸收值,，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計(jì)算待測蛋白的濃度,。
蛋白濃度測定方法如下：
1.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液
取1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中,，將25 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品全溶解,，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液,。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長期保存。
2.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液
取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液,，用PBS或生理鹽水稀釋50倍,，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。注意稀釋時(shí)按照10倍梯度方法稀釋,，確保稀釋準(zhǔn)確,。
3.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）
將蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按0、1,、2,、4、8、12,、16,、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20,、19,、18、16,、12,、8、4,、0 μL將上述梯度工作液補(bǔ)足到20 μL,。得到蛋白濃度依次為0、25,、50,、100、200,、300,、400、500 μg/mL的梯度曲線,。
4.準(zhǔn)備待測樣品
將待測的蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋（可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測,，使樣品蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，確保檢測結(jié)果可信）,，按照每個(gè)樣品20 μL的量加到96孔板中,。待測樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用相同溶液稀釋。
5.配制BCA顯色工作液
將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻,，得到BCA顯色工作液,。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內(nèi)使用,。每個(gè)待測樣品需200 μL,，建議按需配制，避免浪費(fèi),。
6.檢測
向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL,，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應(yīng)30 min后,，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)做參比,，在562 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值,。（注：也可以在室溫反應(yīng)2 h,，或60℃反應(yīng)30 min,。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應(yīng)）
7.計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標(biāo),，吸光值為縱坐標(biāo),，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測樣品的吸光值,，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL）,，再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測樣品實(shí)際蛋白濃度。
提示：
1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時(shí)間的影響較大,，吸光度值會(huì)隨著時(shí)間的延長或溫度升高而變化,，如果不能精確控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度，建議每次測定都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。
2. 在進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制時(shí),，需確保溶解充分,。稀釋配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)建議10倍梯度稀釋,，不要一次稀釋50倍,，以免產(chǎn)生較大誤差。
3. 為保證蛋白的精確定量,，樣品的提取和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液,，同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值,，建議使用其他的方法測定,。
4. 操作時(shí)請穿實(shí)驗(yàn)服，并佩戴一次性手套,。