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       基因擴(kuò)增技術(shù)(PCR)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction簡(jiǎn)稱PCR)又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新,。
 

　　 PCR擴(kuò)增DNA的原理是：先將含有所需擴(kuò)增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開為兩個(gè)寡聚核苷酸單鏈,，然后加入一對(duì)根據(jù)已知DNA序列由人工合成的與所擴(kuò)增的DNA兩端鄰近序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物,。此引物范圍就在包括所欲擴(kuò)增的DNA片段,，一般需20-30個(gè)堿基對(duì)，過少則難保持與DNA單鏈的結(jié)合,。引物與互補(bǔ)DNA結(jié)合后,，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性(退火),，在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷(dNTP)為原料按5'到3'方向?qū)⒁镅由?、自?dòng)合成新的DNA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈,。然后又開始第二次循環(huán)擴(kuò)增,。引物在反應(yīng)中不僅起引導(dǎo)作用，而且起著特異性的限制擴(kuò)增DNA片段范圍大小的作用,。新合成的DNA鏈含有引物的互補(bǔ)序列,，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復(fù)性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過程,，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍,，亦即擴(kuò)增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán),，使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增,。
 

　　 PCR的擴(kuò)增倍數(shù)Y=(1+E)n,這里Y是擴(kuò)增量，n為PCR的循環(huán)次數(shù)。E為PCR循環(huán)擴(kuò)增效率,。設(shè)PCR擴(kuò)增效率E為100%,、循環(huán)次數(shù)n=25次，靶DNA將擴(kuò)增到33554432個(gè)拷貝,，即擴(kuò)增3355萬倍：若E為80%,、n=20、則擴(kuò)增數(shù)量將下降到1408865拷貝,，即擴(kuò)增產(chǎn)物約丟失93%，若E=100%,，n=20,，則擴(kuò)增數(shù)量減少1048576個(gè)拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物約減少97%,?？梢奝CR循環(huán)擴(kuò)增效率及循環(huán)次數(shù)都對(duì)擴(kuò)增數(shù)量有很大影響。PCR擴(kuò)增屬于酶促反應(yīng),，所以,，DNA擴(kuò)增過程遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理。靶DNA片段的擴(kuò)增最初表現(xiàn)為直線上升,，隨著靶DNA片段的逐漸積累,，當(dāng)引物—模板/DNA/聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的促化反應(yīng)趨于飽和,，此時(shí)靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加,，即出現(xiàn)所謂平臺(tái)效應(yīng)。PCR反應(yīng)達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間主要取決于反應(yīng)開始時(shí)樣品中的靶DNA的含量和擴(kuò)增效率,，起始模板量越多到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間就越短,、擴(kuò)增效率越高到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間也越短。另外酶的含量,，dNTp 濃度,，非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增都對(duì)到達(dá)平臺(tái)期時(shí)間有影響。
 

　　PCR的特點(diǎn)： 

　　一,、特異性高 

　　報(bào)導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段,，其酶活性在90℃會(huì)變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段,，同時(shí)引物是在37℃延伸(聚合)易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯(cuò)配,、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶,，在熱變性處理時(shí)不被滅活,，不必在每次循環(huán)擴(kuò)增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性,，序列分析證明其擴(kuò)增的DNA序列與原模板DNA一致,。擴(kuò)增過程中，單核苷酸的錯(cuò)誤參入程度很低,、其錯(cuò)配率一般只有約萬分之一,，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對(duì)的特異寡核苷酸引物,。PCR能一次確定病毒的多重感染,。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測(cè)病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。
 

　　二,、高度敏感 

　　理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上,，實(shí)際應(yīng)用已證實(shí)可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地?cái)U(kuò)增到足夠檢測(cè)分析量的DNA。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞,，或?qū)χT如病人口液等只含一個(gè)感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測(cè),。
 

　　三、快速及無放射性

　　一般在2小時(shí)內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴(kuò)增,，加上用電泳分析,。只需3-4小時(shí)便可完成，不用分離提純病毒,，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物,，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液,、尿液,、洗液、脫落毛發(fā),、細(xì)胞,、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴(kuò)增檢測(cè)，省去費(fèi)時(shí)繁雜的提純程序,，擴(kuò)增產(chǎn)物用一般電泳分析即可,，不一定用同位素，無放射性易于推廣,。
 

　　四,、簡(jiǎn)便

　　擴(kuò)增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法,，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因,，省去常規(guī)方法中須先進(jìn)行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測(cè),。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn),，擴(kuò)增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點(diǎn)的載體中。
 

　　五,、可擴(kuò)增RNA或cDNA 

　　先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA,，再將得到的單鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%,，也能經(jīng)PCR擴(kuò)增1ng有242堿基對(duì)長(zhǎng)度的特異片段,，有些外顯子分散在一段很長(zhǎng)的DNA中，難以將整段DNA大分子擴(kuò)增和做序列分析,。若以mRNA作模板,，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對(duì)外顯子的擴(kuò)增并進(jìn)行序列分析,。