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聚合酶鏈反應（PCR）體系主要成份組成解讀
閱讀：903 發(fā)布時間：2024-9-2聚合酶鏈反應（PCR）是一種常用的分子生物學技術，可用于擴增DNA序列,。在PCR反應中,，引物是起關鍵作用的短鏈DNA分子，它們會與待擴增DNA序列的兩端匹配,，指示聚合酶在這些位置開始復制DNA,。PCR反應體系由反應緩沖液（PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）,、Taq DNA聚合酶（Taq 酶）,、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）,、 Mg2+,、靶序列（DNA模板）主要成份組成。各個組份對PCR結果至關重要,。
1,、 反應緩沖液（PCR Buffer）
（1）、反應緩沖液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8),， 50 mmol/L KCl和適當濃度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃時pH為8.3-8.8,，但在實際PCR反應中,，pH為6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火,。
（2）、反應液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),，它們可穩(wěn)定酶活性,，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的DNA片段有利。
（3）,、各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液,。
2、 脫氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）
dNTP包括dATP,、dTTP,、dGTP、dCTP,。dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性,。多次凍融會使dNTP降解,。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低,。當PCR需要較高濃度的dNTP時,，應在反應體系中適當增加Mg2+的濃度。
（1）dNTP應用NaOH 將pH調至7.0,，并用分光光度計測定其準確濃度,。
（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分裝，-20℃貯存,。一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200 μmol/L,。
（3）理論上4 種 dNTP各20 μmol/L，足以在100 μl反應中合成2.6 μg的DNA,。當dNTP終濃度大于50 mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性,。4種dNTP的濃度應該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入,。
3,、 Taq DNA聚合酶（Taq 酶）
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min，95℃ 40 min,， 97℃ 5 min?，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間,。
Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,，30 min，摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量,。Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,，一般PCR中出錯率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán),，在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應注意.在100 μl PCR反應中，1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán),。
所用的酶量可根據DNA,、引物及其它因素的變化進行適當?shù)脑鰷p.酶量過多會使產物非特異性增加，過少則使產量降低,。
反應結束后,，如果需要利用這些產物進行下一步實驗，需要預先滅活Taq DNA聚合酶,， 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：
（1）PCR產物經酚: 抽提,，乙醇沉淀。
（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ ,。
（3） 99-100℃加熱10 min,。目前已有直接純化PCR產物的Kit可用。
4,、 寡聚核苷酸引物
PCR反應產物的特異性由一對上下游引物所決定,。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：
（1） 引物長度約為16-30 bp,， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對,，從而使非特異性增高。太長則比較浪費,，且難以合成,。
（2）引物中G+C含量通常為40%-60%，可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T),。
（3）四種堿基應隨機分布,，在3'端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣易導致錯誤引發(fā),。
（4）引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應,， 以減少由于密碼子擺動產生的不配對。
（5）在引物內,， 尤其在3'端應不存在二級結構,。
（6）兩引物之間尤其在3'端不能互補， 以防出現(xiàn)引物二聚體,， 減少產量,。兩引物間最好不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。
（7）引物5'端對擴增特異性影響不大,， 可在引物設計時加上限制酶位點,、核糖 體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素,、熒光素等,。通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。
（8）引物不與模板結合位點以外的序列互補,。所擴增產物本身無穩(wěn)定的二級結構， 以免產生非特異性擴增,，影響產量,。
（9）簡并引物應選用簡并程度低的密碼子， 例如選用只有一種密碼子的Met,， 3'端應不存在簡并性,。否則可能由于產量低而看不見擴增產物。
（10）一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1.0 μmol/L,。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體,， 過低則降低產量。利用紫外分光光度計,， 可精確計算引物濃度,， 在1cm光程比色杯中，260nm下,，引物濃度可按下式計算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩爾濃度,，A、C,、G,、T：引物中4種不同堿基個數(shù)。
5,、 Mg2+
（1）Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大,，它可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度,， 影響產物的特異性以及引物二聚體的形成等,。
（2）通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2 mmol/L.對于一種新的PCR反應，可以用0.1-5 mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進行預備實驗,，選出最適的Mg2+濃度,。
（3）在PCR反應混合物中， 應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團,， 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質,，以保證最適Mg2+ 濃度。
6,、 靶序列（DNA模板）
（1）PCR反應必須以DNA為模板進行擴增,， 模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子,，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好),。
（2）就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應中的模板數(shù)量為102 -105 個拷貝,，對于單拷貝基因,，這需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA,，1ng的大腸桿菌DNA.擴增多拷貝序列時,，用量更少。
（3）靈敏的PCR可從一個細胞,，一根頭發(fā),，一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。
（4）模板量過多則可能增加非特異性產物,。DNA中的雜質也會影響PCR的效率,。
注意事項：
1.PCR應該在沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行，最好設立一個專用的PCR配制室,、模板室,、擴增室，避免污染（16S）,。
2.純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響,。一般而言，只要能夠得到可靠的結果,，純化的方法越簡單越好,。
3.所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染，操作過程中均應戴手套,。
4.PCR試劑配制應使用最高質量的新鮮雙蒸水,，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高溫高壓滅菌。5.試劑都應該以大體積配制,，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性與平行性。
6.試劑或樣品準備過程中都要使用滅菌的tubes和tips,，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌,。
7.PCR配制試劑應在冰上融化，并且要瞬離并充分混勻,。