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酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）測定技術(shù)要點匯集
閱讀：162 發(fā)布時間：2024-8-29酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme linked immunosorbent assay,，ELISA）是將抗原或抗體結(jié)合在固相載體表面,，利用抗原抗體的特異性結(jié)合以及抗體或者抗原上標(biāo)記的酶催化特定底物發(fā)生顯色反應(yīng),，實現(xiàn)目標(biāo)物檢測的免疫分析方法,，可測至皮摩爾（pmol）級別。
技術(shù)原理：
ELISA可用于測定抗原,，也可用于測定抗體,。
（1）、將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上,，并保持其免疫活性,。
（2）、測定時,，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng),。
（3）、用洗滌的方法分離抗原-抗體復(fù)合物和游離成分,。
（4）,、加入酶的作用底物催化顯色，進行定性或定量,。
酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）測定質(zhì)量把控要點：
1. 測定模式的影響
ELISA測定模式包括：雙抗體夾心法,、間接法、雙抗原夾心法,、IgM抗體捕捉法,、競爭抑制法，其中競爭抑制法因受操作時差所引起的bu公平競爭等因素的影響,，結(jié)果重復(fù)性較差,，質(zhì)量較難控制。
2. ELISA試劑的準(zhǔn)備
不同批次的試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量一致,，即使是通過批批檢的項目其檢測結(jié)果也存在差異,，因此必須選擇和訂購長批號的試劑,，并保證保存條件。
嚴格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免因試劑批號改變而重新建立質(zhì)控體系及重新評估試劑的復(fù)雜過程,，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性,；對于效期短、使用率低的試劑,，應(yīng)當(dāng)小量分裝,，每次使用則取分裝部分即可，避免反復(fù)凍融造成試劑的失效,。
試劑使用前必須平衡至室溫,，否則會影響檢測下限。未用完的室內(nèi)質(zhì)控品及本次不需使用的試劑應(yīng)密封并及時放回冰箱保存,。
3. 操作因素對ELISA結(jié)果的影響
目前各種形式的ELISA自動分析儀已經(jīng)進入市場,，如廣泛應(yīng)用于血站系統(tǒng)的微板式全自動酶免分析儀，其試劑為開放式的,，而對于其它類型的儀器,，則試劑和儀器往往是配套的。但當(dāng)前大部分醫(yī)學(xué)實驗室均采用手工操作加儀器測定的方式,。ELISA操作步驟復(fù)雜,，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。
ELISA測定一般遵循以下步驟：固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結(jié)合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色
4. 灰區(qū)的設(shè)置
通常情況下,，ELISA定性實驗以“陽性"和“陰性"來報告結(jié)果,，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值"(CO值)，這是定性免疫測定結(jié)果報告的依據(jù),。由于ELISA CO值的設(shè)置不能區(qū)分所有正常和異常的人群,，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA檢測具有以下幾個特點：檢測變異大(18%～65%),；不同試劑盒CO值存在差異,；病毒感染存在窗口期；病毒變異后表達產(chǎn)物含量低以及個體差異等,，因此在CO值附近存在一個臨床意義可疑的的區(qū)域被稱之為“灰區(qū)",，在國內(nèi)的傳染性病原體抗原和抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及“灰區(qū)"的設(shè)置，但僅僅依靠CO值來決定感染的有無,，尤其是對獻血員的篩查具有較大的風(fēng)險,。因此對于檢測結(jié)果位于“灰區(qū)"的病人可采用確認實驗或追蹤檢測的辦法加以確診。
目前“灰區(qū)"的設(shè)置有二種方式：一是CO×(1±CV),， CV為該試劑的批內(nèi)CV (一般在15-20%),；二是CO±2s，s為實驗室做室內(nèi)質(zhì)控ROC(常規(guī)條件下的變異)的標(biāo)準(zhǔn)差。
5. 標(biāo)本復(fù)查
ELISA手工檢測過程復(fù)雜,，影響因素較多,，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成結(jié)果的差異,，因此加大復(fù)查力度是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的可靠方法。
復(fù)查方式主要有：
① 采用同一種試劑復(fù)查,，理由是市售試劑均通過國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）認可,，嚴格按照其說明書操作，檢測結(jié)果具有法律效應(yīng),，若使用不同的試劑（非確證試驗）復(fù)查,，當(dāng)結(jié)果不相符合時，則zui終結(jié)果難以判斷（免疫檢測缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)"）,。
② 采用國外進口試劑進行復(fù)查,，其理由是盡管進口試劑并不是“金標(biāo)準(zhǔn)"，但實驗室已經(jīng)對此高度重視,，并且使用了質(zhì)量較好,，價格較貴的試劑，但該法對于小醫(yī)院而言則很難實施,。
6. 結(jié)果判斷和報告
① 定性測定
陽性判定值法：
一般為陰性對照的平均A值加一個常數(shù),，試劑制備、檢測過程必須嚴格標(biāo)準(zhǔn)化,，要先計算出陽性對照A值平均數(shù)和陰性對照A值平均數(shù),。
② 半定量測定：
結(jié)果一般以滴度表示。將標(biāo)本連續(xù)稀釋后,，進行ELISA檢測,，在陽性臨界值以上的zui高稀釋度即為該標(biāo)本的“滴度"。
③ 定量測定：
即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋后進行ELISA測定,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，結(jié)果以絕對量或單位表示。在ELISA定量檢測中每一塊反應(yīng)板都必須繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,。
④ 結(jié)果報告：
傳統(tǒng)的ELISA結(jié)果只報告“陽性"或者“陰性",，但不能解決“灰區(qū)"的問題，因此引入“可疑"的報告方式是比較合理和科學(xué)的,，同時對結(jié)果做必要的說明,，如“結(jié)果已經(jīng)復(fù)查，建議定期復(fù)查或定量檢測",；對于HBeAb,、HBcAb檢測，由于各試劑盒CO值差異及變異系數(shù)大等因素,，結(jié)果缺乏可比性,，位于CO值附近的標(biāo)本復(fù)查結(jié)果陰陽性只是概率事件,，另外HBcAb存在原倍和1：30檢測模式及定量檢測模式，報告結(jié)果的不一致對于臨床實驗室來說是不可回避,，也是目前醫(yī)療糾紛主要集中點和“結(jié)果互認"的zui大障礙,，因此在減小室內(nèi)變異的同時必須引入陽性和弱陽性的報告方式。
7. 原始記錄
ELISA檢測結(jié)果變異大,，不同體系難以溯源,，因結(jié)果不一致而引起的醫(yī)療糾紛逐日增多，因此ELISA檢測的原始存根必須完整而全面地保存,，包括布局,，原始吸光度值，檢測的陰陽結(jié)果,，檢測者,，試劑，批號,，質(zhì)控品來源及批號等,。嚴禁人為修改檢測結(jié)果。
8. 室內(nèi)質(zhì)量控制
① 室內(nèi)質(zhì)控品：穩(wěn)定以及合適的濃度是運用一切質(zhì)控規(guī)則的前提,?？蛇x擇S/CO值減去精密度測定中得到的三倍批間CV%與該S/CO值的乘積仍大于1的質(zhì)控血清作監(jiān)測重復(fù)性的室內(nèi)質(zhì)控品用。 計算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD,。同時選擇S/CO處于1.5左右的質(zhì)控血清以判斷每次測定時試劑盒測定下限的有效性,。
② “即刻性"質(zhì)控：一些實驗室不是每天進行ELISA項目的檢驗，而ELSIA部分試劑盒效期短,，用同一批號試劑盒連續(xù)常規(guī)測20次,，難度較大。采用"即刻法"質(zhì)控統(tǒng)計方法,，只需連續(xù)測3次,，即可對第3次檢驗結(jié)果進行質(zhì)控。
A. 先將測定值從小到大排列,，X1最小,，Xn最大；
B. 計算X和s,；
C. 計算SI上限值和下限值,。SI上=（Xzui小-X）/S，SI下=（Xzui大-X）/S,；
D. 對照SI表,，檢查是否出控。SI上、下限≤規(guī)定值,，在控,； SI上或下限>規(guī)定值，失控,。
③ Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法 Levey-Jennings質(zhì)控圖以及Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法zui早應(yīng)用于生化檢測的質(zhì)量控制,，在ELISA檢測中仍為探索階段，一般認為：
A. 一 次超出3SD,；
B. 連續(xù)二次超出2SD,；
C. 3～5次連續(xù)處于一側(cè)的2SD之內(nèi)；
D. 5～7次連續(xù)偏向橫軸的一側(cè),，均為失控。目前多采用一次超過2SD作為“告警",，一次超出3SD為“失控",。
9. 總結(jié)
ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒測定方法是以抗原抗體間的特異反應(yīng)為基礎(chǔ)的，其與生化的化學(xué)反應(yīng)有著本質(zhì)的區(qū)別,，酶聯(lián)免疫測定技術(shù)從低敏捷的免疫沉淀和免疫凝集反應(yīng)進入到了高敏捷的放射免疫,、酶免疫、熒光免疫和發(fā)光免疫測定時代,，可見酶聯(lián)免疫測定更多的是用于生物活性物質(zhì)的微量測定,。