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ELISA試劑盒中HRP底物使用操作步驟
閱讀：235 發(fā)布時(shí)間：2024-7-15ELISA試劑盒中HRP底物范圍較廣,，HRP即辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase）比活性高，穩(wěn)定,，分子量小,，純酶容易制備，所以zui 常用,。過氧化物酶作為多個(gè)試劑盒顯色體系的關(guān)鍵成分,，對(duì)試劑盒的質(zhì)量有重要影響,。HRP底物主要包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等,。
一,、二氨基聯(lián)苯胺／金屬鹽
DAB是辣根過氧化物酶最敏感、常用的底物,。它產(chǎn)生強(qiáng)烈的棕色產(chǎn)物，在水和醇中不溶解,。多數(shù)情況下,，推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當(dāng)加入金屬鹽如鈷,、鎳至底物液中,，辣根過氧化物酶可以更加敏感。此類反應(yīng)產(chǎn)物呈暗藍(lán)灰色至黑色,，且在水及醇中穩(wěn)定,。DAB／金屬鹽染色應(yīng)用的組織染色范圍較廣。
1. 需要的溶液和特殊設(shè)備
DAB,，0.05 mol／LTris緩沖液(pH7.6), 0.3％ (W/V) 氯化鎳/水貯存液, 30％過氧化氫, DPX, 光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果).
2. 操作步驟
(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris緩沖液(pH7.6)溶解6 mg DAB,；
(2) 加 l mL 0.3％(W/V)氯化鎳/水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代)；
(3) 加0.1 mL 3％過氧化氫,。過氧化氫一般以30％的溶液提供,，貯存在4 ℃，此條件可以持續(xù)1個(gè)月,；
(4) 如果出現(xiàn)沉淀,，用濾紙過濾；
(5) 加此溶液至標(biāo)本,，并孵育1~20 min水洗終止反應(yīng),；
(6) 優(yōu)化：如果需要可復(fù)染；
(7) 用DPX封片,。
二,、氯萘酚
氯萘酚可以形成一種藍(lán)黑色產(chǎn)物。敏感性低于DAB,，且產(chǎn)物可溶于醇中,。它適用于當(dāng)DAB反應(yīng)形成較高背景或要求改變產(chǎn)物的顏色。
1. 需要的溶液和特殊設(shè)備
0.03％氯萘酚,，用無水乙醇溶解(貯存在-20℃),，0.05 mol／LTris(pH7.6)，過氧化氫,，Gelvatol或者M(jìn)owiol,，光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果),。
2. 操作步驟
(1) 氯萘酚貯存液的準(zhǔn)備：用10 mL無水乙醇溶解0.3 g氯萘酚，貯存于-20℃,；
(2) 加100 μL 氯萘酚貯存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6),；
(3) 加0.1 mL 3％過氧化氫于水中。過氧化氫一般是以30％的溶液提供,，4℃可存放1個(gè)月,；
(4) 白色沉淀可用濾紙過濾去除；
(5) 加此溶液到標(biāo)本中,，并在室溫孵育10～40 min,，水洗終止反應(yīng)；
(6) 優(yōu)化：如果需要,，進(jìn)行復(fù)染,，但只可使用水溶性染料；
(7) 用Gelvatol或者M(jìn)owiol封片,。
三,、氨乙基咔唑
氨乙基咔唑(AEC)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物，其敏感性低于DAB,，但可用于DAB反應(yīng)產(chǎn)生較高背景或要求改變產(chǎn)物顏色的實(shí)驗(yàn),。此產(chǎn)物可溶于醇，但不溶于水,。
1. 需要的溶液和特殊設(shè)備
0.4％ AEC用 N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解,， 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.2)，過氧化氫,， Gelvatol或Mowiol,，光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)。
2. 操作步驟
(1) 用 l mL DMF溶解 4 mg AEC,。AEC在DMF中穩(wěn)定,，因此，可以用100 mL DMF溶解0.4 g AEC作為貯存液備用,；
(2) 加 l mL AEC溶液至15 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.2)中,，并攪拌；
(3) 加0.15 mL 3％過氧化氫于水中,。過氧化氫一般是30％的溶液提供,，在4℃可存放1個(gè)月；
(4) 用濾紙過濾,；
(5) 加此溶液到標(biāo)本中,，并于室溫孵育10～40 min，水洗終止反應(yīng),；
(6) 優(yōu)化：如果需要復(fù)染,，只可用水溶性染料,；
(7) 用Gelvatol或Mowiol封片。