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       ELISA試劑盒中HRP底物范圍較廣,，HRP即辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase）比活性高,，穩(wěn)定,，分子量小,，純酶容易制備，所以zui 常用,。過氧化物酶作為多個試劑盒顯色體系的關鍵成分,，對試劑盒的質(zhì)量有重要影響,。HRP底物主要包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等,。

一,、二氨基聯(lián)苯胺／金屬鹽

DAB是辣根過氧化物酶最敏感、常用的底物,。它產(chǎn)生強烈的棕色產(chǎn)物,，在水和醇中不溶解。多數(shù)情況下,，推薦在DAB中加入不同的金屬離子,。當加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中,，辣根過氧化物酶可以更加敏感,。此類反應產(chǎn)物呈暗藍灰色至黑色，且在水及醇中穩(wěn)定,。DAB／金屬鹽染色應用的組織染色范圍較廣,。

1.     需要的溶液和特殊設備

DAB，0.05 mol／LTris緩沖液(pH7.6), 0.3％ (W/V) 氯化鎳/水貯存液, 30％過氧化氫, DPX, 光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果).

2.     操作步驟

(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris緩沖液(pH7.6)溶解6 mg DAB,；

(2) 加 l mL 0.3％(W/V)氯化鎳/水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代),；

(3) 加0.1 mL 3％過氧化氫。過氧化氫一般以30％的溶液提供,，貯存在4 ℃,，此條件可以持續(xù)1個月；

(4) 如果出現(xiàn)沉淀,，用濾紙過濾,；

(5) 加此溶液至標本，并孵育1~20 min水洗終止反應,；

(6) 優(yōu)化：如果需要可復染,；

(7) 用DPX封片。

 

二,、氯萘酚

氯萘酚可以形成一種藍黑色產(chǎn)物,。敏感性低于DAB，且產(chǎn)物可溶于醇中,。它適用于當DAB反應形成較高背景或要求改變產(chǎn)物的顏色,。

1.     需要的溶液和特殊設備

0.03％氯萘酚，用無水乙醇溶解(貯存在-20℃),，0.05 mol／LTris(pH7.6),，過氧化氫，Gelvatol或者Mowiol,，光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果),。

2.     操作步驟

(1) 氯萘酚貯存液的準備：用10 mL無水乙醇溶解0.3 g氯萘酚,，貯存于-20℃；

(2) 加100 μL 氯萘酚貯存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6),；

(3) 加0.1 mL 3％過氧化氫于水中。過氧化氫一般是以30％的溶液提供,，4℃可存放1個月,；

(4) 白色沉淀可用濾紙過濾去除；

(5) 加此溶液到標本中,，并在室溫孵育10～40 min,，水洗終止反應；

(6) 優(yōu)化：如果需要,，進行復染,，但只可使用水溶性染料；

(7) 用Gelvatol或者Mowiol封片,。

 

三,、氨乙基咔唑

氨乙基咔唑(AEC)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物，其敏感性低于DAB,，但可用于DAB反應產(chǎn)生較高背景或要求改變產(chǎn)物顏色的實驗,。此產(chǎn)物可溶于醇，但不溶于水,。

1.     需要的溶液和特殊設備

0.4％ AEC用 N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解,， 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.2)，過氧化氫,， Gelvatol或Mowiol,，光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。

2.     操作步驟

(1) 用 l mL DMF溶解 4 mg AEC,。AEC在DMF中穩(wěn)定,，因此，可以用100 mL DMF溶解0.4 g AEC作為貯存液備用,；

(2) 加 l mL AEC溶液至15 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.2)中,，并攪拌；

(3) 加0.15 mL 3％過氧化氫于水中,。過氧化氫一般是30％的溶液提供,，在4℃可存放1個月；

(4) 用濾紙過濾,；

(5) 加此溶液到標本中,，并于室溫孵育10～40 min，水洗終止反應,；

(6) 優(yōu)化：如果需要復染,，只可用水溶性染料,；

(7) 用Gelvatol或Mowiol封片。